细胞免疫标记检验

第四节　细胞免疫标记检验

细胞分子生物学的发展，为血液病的诊断提供了最有价值性的诊断依据，由于细胞表面及细胞内所携带或表达一系列特异性抗原，应用单克隆抗体进行免疫标记测定，提高了白血病诊断的科学性、准确性与客观性。

一、生物素-亲和素酶标法

【原理】亲和素酶标法（ABC）是依据亲和素和生物素二者间有很强的亲和力，生物素可以和抗体相结合，且结合后仍保持与亲和素连接的能力。辣根过氧化物酶标记在亲和素与生物素复合物上形成生物素-亲和素-过氧化物酶复合物即ABC，细胞抗原成分与特异性抗体第1结合后，与已标记上生物素的第2抗体反应，再与ABC结合。ABC上辣根过氧化物酶作用于显色剂，使其产生有色沉淀，指示抗原的存在。

【结果】（同APAAP法）

二、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶侨联酶标法

【原理】碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶侨联酶标（APAAP）法，是用碱性磷酸酶作为标记物标记已知抗体或抗抗体，进行抗原抗体反应。先用鼠单抗制备一种碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶单克隆抗体（APAAP）复合物，然后按照细胞抗原成分与第1抗体（鼠抗人单抗）、第2抗体（兔抗鼠抗体）、APAAP复合物依次结合后，通过碱性磷酸酶水解外来底物显色，达到定位。

【结果】高倍镜下计数200个有核细胞，其中细胞膜或细胞浆内有红色标志物着色的细胞为阳性，无红色标志物着色的细胞为阴性。计算出阳性率。

三、流式细胞仪检测法

【原理】流式细胞仪是将标本用荧光素标记的悬液标记细胞，通过流式细胞仪的毛细管，分辨细胞形态、大小及荧光特征。流式细胞仪利用计算机记录处理，快速对各个细胞进行参数定量分析的方法。

【结果】流式细胞术的数据显示以直方图形式表示。

1.单参数直方图　它是一维数据用得最多的图形，可用来进行定性分析和定量分析。在图中横坐标表示荧光信号或散射光强度的相对值，其单位为“道数”。纵坐标通常表示细胞出现的频率或相对细胞数。

2.二维点阵图　为了显示两个独立数与细胞定量的关系，可采用二维点阵图的方式。例如在点阵图的横坐标是CD8淋巴细胞的相对含量，纵坐标是CD4细胞的相对含量。图上每一个点代表一个细胞，每个带你与纵轴的距离即表示该点的相对值CD4值。可以由点阵图得到两个直方图，但两个直方图无法反演成一个二维点阵图。

【临床意义】

抗人白细胞抗原CD系列单克隆抗体与流式细胞仪和多色荧光染料的联合应用，成为研究造血细胞免疫表型，分化发育、激活增殖、生物学功能和恶性变关系及造血细胞分离纯化强有力的手段，促进了血液学和免疫学的发展。

1.对造血干、祖细胞的研究/或CD34⁺造血干细胞（HSC）/祖细胞（HPC）分析与鉴定，由于CD34⁺ HSC/ HPC具有自我更新、多向分化以及重建长期造血细胞的细胞生物学性质与功能，分离纯化造血干/祖细胞具有重要理论与应用价值，也是研究造血增殖、分化、调节机制、干/祖细胞体外扩增、干细胞库的建立、造血干细胞移植净化以及基因治疗等的条件和手段。人类CD34⁺细胞已成为能识别人类最早造血干/祖细胞的重要标志。人类CD34⁺细胞分别占骨髓、脐血和外周血有核细胞的1%～4%，0.5%～1.5%和0.05%～0.1%。

2.T淋巴细胞亚群检测　-用CD4和CD8单抗可将外周淋巴器官和血液中的T细胞分为CD3+CD4+CD8-（Th）和CD3+CD4-CD8+（Ts）两个主要亚群。同时也可测定NK细胞及B淋巴细胞亚群等。临床上常测定T淋巴细胞亚群，计算CD3+CD4-CD8- 、CD3+CD4+CD8-（Th）和CD3+CD4-CD8+（Ts）的量，并计算CD3+CD4+CD8-（Th）/CD3+CD4-CD8+（Ts）比值作为免疫状态，在某些疾病的诊断、病情分析、监测治疗和判断预后的参数。同时又是移植排斥反应的参考指标。

3.急性白血病分型诊断　白血病是白血病细胞分化到某个阶段受到阻滞后呈克隆性异常增殖的结果。它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病其发病机制不同，白血病细胞具有与其对应的正常细胞相同的分化抗原，利用白血病细胞表面的抗原标记进行免疫分型。该法结合细胞形态学、细胞化学可明显提高对血液细胞的识别能力，对白血病分型诊断准确率由传统的60%～70%提高到97%。

4.恶性淋巴瘤分类　淋巴瘤的正确分类有助于提高诊断治疗效果和预后的客观判断。免疫表型、组织病理学和细胞学的结合，使淋巴瘤的分类与诊断更为合理准确，能反映其生物特性。

（1）通过淋巴细胞表型进行连续评价，可弄清淋巴细胞分化过程中各阶段细胞抗原表达的情况。一个单一表型淋巴细胞群体的检出，表明某一淋巴细胞亚群的单克隆性增生，这是恶性淋巴瘤的特征。

（2）利用单克隆抗体和细胞免疫标记技术不仅可以确定淋巴瘤细胞的来源（B细胞、T细胞、组织细胞或树突细胞），而且可对细胞在组织中的分布情况进行精确观察。如B细胞淋巴细胞瘤单一细胞群体的标志，是具有某一种类型的轻链或重链或某种特定B细胞抗原的表达。

5.白血病微量残留的检测　通过检测白血病细胞特异性抗原来研究微量残留，观察有无特异性抗原标志细胞的比率的大小，还有某些特殊标志物如TdT正常只表达于T细胞上，存在于胸腺和骨髓有限的细胞中，大部分白血病细胞表达TdT，因此如果在外周血和脑脊液里发现TdT阳性细胞，可定为恶性细胞。应用多种标志组合的方式，包括CD34、CD56、TdT，淋巴抗原，结合其抗原密度，可以灵敏的检测大部分白血病的微量残留。

6.对血小板的研究　血小板膜糖蛋白是血小板参与止血与血栓形成等多种病理生理反应的基础。应用抗血小板膜糖蛋白抗体作为分子探针对血小板进行免疫荧光标记检测，对临床上诊断先天性、获得性血小板膜糖蛋白异常所致的疾病诊断、治疗、预防，尤其是针对血栓性疾病的诊断、预防由重要的理论与实践依据。如CD62P、CD63是活化血小板最为特异灵敏度分子标志物。血小板无力症其CD41、CD61明显缺乏。巨大血小板综合征有CD42b、CD42ad的缺乏。

7.骨髓移植及免疫重建的鉴定　可通过标记的CD34当克隆抗体检测外周血中的干细胞并定量。对移植前骨髓细胞免疫表型分析，可了解骨髓处理状况，如T细胞的剔除，化学净化和用免疫磁珠对特殊细胞进行剔除的结果，并能确定病人进行移植的类型。还可研究各种细胞因子在移植前的变化与并发症的因果关系。并可检测活化淋巴细胞来诊断移植排斥反应，若发现CD8⁺HLA-DR⁺细胞增加，表示可能产生排斥现象。