检测体液和细胞免疫功能的体内试验

检测体液和细胞免疫功能的体内试验_免疫学与免疫制剂

第四节　检测体液和细胞免疫功能的体内试验

皮肤试验是测定机体体液和细胞免疫状态的一种体内试验，用于过敏性疾病、传染病、免疫缺陷性疾病和肿瘤等的诊断、防治、疗效和预后的判定。

一、检测体液免疫的皮肤试验

（一）速发型超敏反应皮肤试验

注射青霉素、普鲁卡因、抗毒素血清等均需进行皮肤试验，以判定体内特异性IgE产生情况和机体的致敏状态。

方法:青霉素100U/m L，抗毒素血清1∶1000，取0.1m L皮内注射，20分钟内观察结果。

结果:皮肤红晕水肿，直径大于1cm，为“＋”。

（二）毒素皮肤试验

1.狄克试验（又称红疹毒素皮肤试验）

红疹毒素是A族链球菌产生的一种外毒素，是引起猩红热皮疹的主要物质。

试验目的:测定机体对猩红热是否易感，检测体内是否具有红疹毒素抗体。

方法:0.1m L红疹毒素注射于前臂皮内，6～24h后观察。

（1）皮肤红斑直径大于1cm，是“＋”，表明受试者体内没有相应抗毒素，对猩红热易感。

（2）局部皮肤不出现红疹——说明注入的红疹毒素已被相应的抗毒素中和，机体对猩红热有抵抗力，不易感。

2.锡克试验——检测机体对白喉免疫力的皮肤试验

方法和结果判定与狄克试验大致相同。注射白喉毒素后24～48h。

（1）局部皮肤红肿“＋”——表明受试者体内没有相应抗毒素，对白喉无免疫力。

（2）局部皮肤不红肿——表明白喉毒素被相应抗体中和，机体对白喉有一定的免疫力。

鉴于有人对白喉毒素有超敏反应，试验时应取另一份白喉毒素80℃5m in破坏毒性，注射于受试者另一前臂皮内作为对照。

二、检测细胞免疫功能的皮肤试验

检测细胞免疫功能的皮肤试验是根据迟发型超敏反应（即细胞免疫反应）的发生机制建立的。抗原注入皮内，经48～72小时观察结果。

（1）局部皮肤红肿、硬结、直径大于0.5cm，为“＋”，表明细胞免疫功能正常。

（2）反应微弱或皮试阴性，表明细胞免疫功能低下。

用途:（1）某些传染病和免疫缺陷病的诊断，（2）观测肿瘤治疗的效果和判断其预后。

常用生物性抗原有:结核菌素（OT）、结核菌纯蛋白衍生物（PPD）、念珠菌素、链激酶-链道酶（SK-SD）和植物性血凝素（PHA）等。

【理解与思考】

1.从血清学试验的一般规律看抗原、抗体检测的实质是什么？你能科普性地描述检测方法吗？

2.体内检测试验的实质是什么？医学上还有哪些体内试验？

3.请将免疫检测与前面几章内容联系起来，如果要检测诸如抗原、抗体、M HC、补体、细胞因子等，该如何检测？为什么？

【课外拓展】

1.其他免疫检测方法还有哪些？

2.如何检测细胞因子的种类及其活性？

【课程实验与研究】

1.设计一个用免疫方法检测某种细菌的实验。

2.设计一种鉴别不同淋巴细胞的实验方法。

3.临床上是如何检测肿瘤抗原的？请设计几种不同的方法检测甲胎蛋白，并请比较其敏感性。

4.《Science》最近报道称发现一类新T细胞。请设计一种方案，鉴别出它不是已经发现的免疫细胞中的一种。

5.《PNAS》报道称“发现保护动物抵抗禽流感新蛋白”，请就它的结构、分子量、生物学活性提出检测方案。

6.法国马赛Mediterranean Aix-Marseille大学的病毒学家Xavier de Lamballerie在2009年年末表示:开展血清抗体测试研究，揭示甲型H1N1流感真实感染数据。请你为研究设计一个方案。

【课程研讨】

1.如果要确诊某种病原微生物或是否得了某种传染病，请设计多种检测方法。并请比较你们小组所设计不同方法的优劣。

2.要检测食品中是否有三聚氰胺，能用免疫检测的方法吗？如可行，请设计检测方法；如不行，说明理由。

3.免疫学检测除了用于医学、生物学，你认为还能用在哪些领域？说明机理。

4.2011年6月15日，澳大利亚科学家发现了一种新的免疫细胞，请设计一种方案，鉴别是否属已发现的免疫细胞中的一种。

5.2010年5月，PNAS报道称“发现保护动物抵抗禽流感新蛋白”，请就它的结构、分子量、生物学活性提出检测方案。

6.流感疫苗常易变异，对疫苗制备造成困难。2011年7月10日，美国和荷兰研究人员称有望开发防治各种类型流感的通用型疫苗。请对可行加以分析、探讨。

【课后思考】

1.凝集试验、免疫标记技术、酶联免疫吸附试验（EL ISA）的概念。

2.试述抗原或抗体检测的应用。

【课外阅读】

严重急性呼吸道综合征的实验室检查

SARS的诊断主要依据起病急、高热、咳嗽及X线胸片显示肺部浸润性改变等临床表现，结合流行病学史以及必要的实验室检查。目前，较为特异的实验室诊断技术有以下几种:

1.分子学检测

许多病毒感染性疾病早期病毒分泌最多，但是在SARS的发病初期，SARS-CoV含量非常少，需要用非常敏感的手段才能检测到低水平的病毒核酸，主要用反转录-聚合酶链反应（reverse transcrip-tion polymerase chain reaction，RT-PCR）或实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测可疑和发病患者的呼吸道分泌物、血液、尿液或粪便等人体标本中的病毒。鼻咽部分泌物为最适用标本，多部位标本联合检测可提高阳性率。Real-time PCR灵敏度极高，可以检测到单个拷贝的病毒基因。但是由于受引物特异性、检测样本采集时间、种类及其处理方法、病毒核酸在样本中的含量以及样本中的酶抑制物等因素的影响，仍有假阴性结果出现。因此，PCR检测结果阴性，并不能确定该患者没有感染SARS-CoV。

2.血清学检测

已建立的检测病人血清抗体的方法有免疫荧光（immunofluorescence assay，IFA）和酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunoabsorbent assay，EL ISA）。血清抗体的研究表明，SARS患者发病后，最早的IgM抗体要在7天左右出现，10天时达到高峰，15天左右下降；抗体IgG 10天后产生，20天左右达到高峰。IFA检测可以检测出SARS-CoV感染10天后患者血清中产生的IgM。ELISA法要在SARS患者出现临床症状21天左右才可检测到稳定的IgG。SARS感染血清学诊断双份血清标本最可靠，故应尽可能采取进展期的标本。IFA检测时应将双份血清标本置于同一张玻片，ELISA检测时应将双份血清标本置于同一块酶免疫反应板内，这样检测的滴度才有可比性。通过这两种不同的血清抗体快速诊断试剂检测，可以鉴别患者是新感染还是曾经有过冠状病毒感染，病人是否产生相应的抗体。但是一般患者在患病初期，血液里虽有病毒，但抗体可能还没有形成，检测结果呈阴性；有时SARS病毒处于潜伏期，尚未出现症状或症状不典型，此时检测结果也是阴性。所以，这两种方法不适合早期诊断。

3.病毒检测

病毒的分离鉴定是确立病原学诊断的“金标准”。同其他冠状病毒不同，SARS-CoV很容易在体外33～37℃培养。利用VERO E6或VERO细胞（从成年长尾猿属的非洲绿猴肾中提取的一种细胞系）来培养或扩增SARS患者的呼吸道分泌物、尿液粪便和血液样品，分离得到的病毒可以进一步验证是否为SARS-CoV。细胞感染24小时即可出现病变。培养细胞进行电镜观察可以确定冠状病毒，但不能肯定是SARS-CoV，最后诊断仍需要通过SARS-CoVRNA的PCR检测或全基因组测序。因此，病毒分离不能快速检测，而且细胞培养阴性也不能排除SARS。因为SARS-CoV为高度传染性，只允许在生物安全水平3级或以上的实验室进行，加上体外细胞培养分离十分复杂和繁琐，所以病毒检测对一般的临床实验室来说并不是一种常规的检测方法。

中国体外诊断行业概况

体外诊断产业，就是指在人体之外通过对人体的血液等组织及分泌物进行检测获取临床诊断信息的产品和服务，在国际上统称IVD（In-Vitro Diagnostics）产业。IVD产业与检验医学构成了既相互区别又相互紧密联系的有机整体，体外诊断产业是检验医学的“工具”和“兵器”，同时检验医学是体外诊断产业的“用户”和“市场”，两者的共同目的是实施体外诊断。有专家指出，临床诊断信息的80%左右来自体外诊断，而其费用占医疗费用不到20%。体外诊断已经成为人类疾病预防、诊断、治疗日益重要的组成部分，是保障人类健康与构建和谐社会日益重要的组成部分。

我国体外诊断产业的发展开始于20世纪80年代，经历20多年的发展，从无到有，从弱到强，现正处于快速增长阶段。从市场角度看，我国是人均消费最低的国家之一，中国以世界1/5的人口，占据全世界IVD产业2%左右的市场份额，2007年全国市场规模在100亿元人民币左右。但是，中国同时是市场增长速度最快的国家，年均增长率在15%～20%。我国IVD用户主要包括1800多家医院、300多家血站，还有日新月异的体检中心，正在兴起的临床检验独立实验室。如果我国城镇居民的医疗水平接近美国全国居民的医疗水平，则我国IVD产业的市场规模将扩大20倍。从制造商或供应商角度看，在我国主要有三类制造商:一类是世界著名的跨国公司，包括IVD产业世界十强，如GE（美国通用）、西门子、罗氏、强生、倍克曼、德林等公司；一类是民族企业中的知名企业，如在香港上市的中生北控生物科技股份有限公司，在国内上市的上海科化、广州达安，在纽约证券所上市的深圳迈瑞等；一类是新兴或中小型的其他民族企业，由于恶性竞争的存在，行业总体赢利水平目前降至10%-20%，企业数量每天都在变化，但总数在1000家左右。从产品上看，目前在临床应用比较广泛、市场广阔的项目上（如免疫试剂中的肝炎、性病和孕检系列，临床生化中的酶类、脂类、肝功、血糖、尿检等系列），国内主要生产厂家的技术水平已基本达到国际同期水平；基因检测中的PCR技术系列已经基本达到国际先进水平，基因芯片、癌症系列正在开始迅速追赶国际水平。从市场环境角度看，法规从无到有，正在借鉴发达国家的成功经验和结合本国国情的原则指导下完善，而用户方面普遍对价格敏感，消费能力不同地区发展不平衡，城乡差别明显。

在2008年新医改政策及国家4万亿放量刺激内需的环境变化下，体外诊断行业面临前所未有的巨大机遇。不仅国内的体外诊断试剂和仪器生产企业，外国资本亦表现出了浓厚兴趣。典型例子是，2008年11月初北京科美东雅生物技术有限公司完成了第二轮高达1650万美元的私募融资，这为其拓展以化学发光（CL IA）体外诊断产品为核心的市场营销网络，进一步确立其IVD品牌实力提供了强大的资金实力。