检测淋巴细胞及其功能的体外试验

检测淋巴细胞及其功能的体外试验_免疫学与免疫制剂

第三节　检测淋巴细胞及其功能的体外试验

一、免疫细胞及其亚类分离、鉴定和检测

（一）外周血单个核细胞的分离

体外检测淋巴细胞，首先需制备外周血单个核细胞（PBM C），常用的方法是葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。红细胞和多形核白细胞的比重（约1.092）大于单个核细胞（约1.075），将抗凝血叠加于比重为1.077的分离液液面上，可通过低速离心将不同比重的细胞分层:红细胞沉于管底；多形核白细胞密集布于红细胞层与分离液之间；血小板悬浮于血浆中；单个核细胞则密集于血浆层与分离液界面。该法分离淋巴细胞的纯度可达95%。若需进一步纯化淋巴细胞，可将单个核细胞铺于培养皿上，由于单核细胞易与玻璃黏附而滞留于平皿表面，未吸附的细胞即主要是淋巴细胞（图10-22）。

图10-22　密度梯度离心法分离单核细胞

（二）淋巴细胞亚群的分离

淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。

1.尼龙棉分离法

将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B细胞易与尼龙棉黏附而滞留于柱上，T细胞则不黏附，借此可分离T细胞与B细胞。

图10-23　E花结分离法

2.E花结分离法

人成熟T细胞表面具有绵羊红细胞（SRBC）受体，能结合SRBC而形成花结（E花结试验），经密度梯度离心，花结形成细胞因比重增大而沉于管底，与其他细胞分离；用低渗法裂解花结中的SRBC，即获得纯化的T细胞（图10-23）。

3.洗淘法

将已知抗特定细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，表达相应表面标志的细胞即结合于培养板表面，与悬液中的其他细胞分离。

4.流式细胞术（flow cytometry，FCM）

借助荧光活化细胞分类仪（fluorescence-activated cell sorter，FACS）对细胞快速鉴定和分类，并进行多参数定量测定和综合分析的技术。样品与经多种荧光素标记的抗体反应，因荧光素发射光谱的波长不同，信号能同时被接收，故能同时分析细胞表面多个膜分子表达及其水平。该法可检测各类免疫细胞、细胞亚类及其比率。此外，借助光电效应，微滴通过电场时出现不同偏向，可分类收集所需细胞。

5.磁分离技术

将特异性抗体与磁性微粒交联，称为免疫磁珠（immunem抗原netic bead，IMB）。IM B可与表达相应膜抗原的细胞结合，应用强磁场分离IMB及其所吸附的细胞，从而对特定的细胞进行分选，此为直接分离法；亦可用二抗包被磁性微珠，与任何已结合鼠源性一抗的细胞进行反应，从而分离细胞，此为间接分离法。

（三）T细胞及其亚群的鉴定和检测

1.E玫瑰花环形成试验

本试验可用于人T细胞的鉴定和检测。绵羊红细胞和人外周血淋巴细胞在4℃孕育1～2小时，检测花环样细胞集团数量。正常人外周血中E玫瑰花环形成细胞占淋巴细胞总数的60%～80%。

2.T细胞单克隆抗体对T细胞及其亚群的鉴定和检测

所用的抗体主要有:CD₃ M cAb、CD₄ M cAb和CD₈ M cAb。

方法:免疫荧光间接法。

外周血淋巴细胞，分别用小鼠抗人CD₃、CD₄、CD₈ McAb（第一抗体）加荧光素标记的兔抗小鼠IgG抗体（第二抗体），在荧光显微镜下观察结合有荧光素标记抗体的细胞，亦可应用FCM自动计数荧光阳性细胞百分率（图10-24）。

图10-24　免疫荧光间接法鉴定T细胞

结果:

（1）被CD₃ M cAb着染荧光的细胞是总T细胞，包括:Th、Th1、Th2、Tc、Ts细胞。

（2）被CD₄ M cAb着染荧光的细胞是Th、Th1、Th2细胞。

（3）被CD₈ M cAb着染荧光的细胞是Tc、Ts细胞。

计数:

100～200个淋巴细胞，计算出染阳性细胞百分率:

CD₃^＋ T细胞占65%～80%。CD₄ T细胞占50%～60%。CD₈^＋ T细胞占20%～30%。CD₄^＋ T细胞与CD8T细胞比值约为2∶1。

图10-25　免疫荧光直接法检测B细胞

（四）B细胞鉴定和检测

m IgM/D是B细胞表面特有的标志，通过对该种标志的检测，可对B细胞进行鉴定和检测。

方法:免疫荧光直接法。

荧光素标记的兔抗人IgM/D抗体加外周血淋巴细胞，直接免疫荧光染色、观察（图10-25）。着染荧光的细胞为B细胞，占淋巴细胞总数的8%～12%。

二、淋巴细胞功能测定（一）T细胞功能检测1.淋巴细胞转化试验原理:T细胞在特异性抗原或有丝分裂原的作用下转变为淋巴母细胞（体积更大、代谢旺盛），根据其转化程度和转化率，测定机体细胞免疫功能状态。

刺激物分为两类:

（1）非特异性刺激物:如各种丝裂原（PH A、Con A、LPS等），抗CD₂、CD₃等细胞表面标志的抗体以及某些细胞因子等；正常人T细胞转化率约为70%。

（2）特异性刺激物:主要是特异性可溶性抗原、细胞表面抗原、结核菌素（OT或PPD）。正常人T细胞转化率为5%～30%。

不同刺激物可刺激不同淋巴细胞分化增殖，从而反映不同淋巴细胞亚群的功能状态。

测定方法:可采用放射性核素掺入法、比色法、荧光素标记法和形态学等方法。

（1）3H-TdR掺入法

在T细胞增殖过程中，胞内DNA、RNA合成增加，应用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）可掺入细胞新合成的DNA中，所掺入放射性核素的量与细胞增殖水平成正比。借助液体闪烁仪测定样品的放射活性，可反映细胞的增殖状况。该法灵敏可靠，应用广泛，但需特殊仪器，易发生放射性污染。

（2）M TT法

M TT是一种噻唑盐，化学名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑，其掺入细胞后可作为胞内线粒体琥珀酸脱氢酶的底物，形成褐色甲臜颗粒并沉积于胞内或细胞周围，甲臢生成量与细胞增殖水平成正相关。甲臢可被盐酸异丙醇或二甲基亚砜完全溶解，借助酶标测定仪检测细胞培养物OD值，可反映细胞增殖水平。该法灵敏度不及3H-TdR掺入法，但操作简便，且无放射性污染。

（3）形态学计数法

淋巴细胞受丝裂原刺激后，转化为淋巴母细胞，其形态和结构发生明显改变，通过染色镜检，可计算出淋巴细胞转化率。

2.淋巴细胞参与的细胞毒性试验（LMC-T）

CTL、NK细胞可直接杀伤不同靶细胞（如肿瘤细胞、移植供体细胞等）。通过检测杀伤活性可用于肿瘤免疫、移植排斥反应、病毒感染等方面研究。

（1）⁵¹ Cr释放法

用Na⁵¹₂ CrO₄标记靶细胞，被效应细胞杀伤的靶细胞释放51 Cr，应用γ计数仪测定所释出的51 Cr放射活性，可反映效应细胞的杀伤活性（图10-26）。

（2）乳酸脱氢酶（LDH）释放法

效应细胞-靶细胞进行反应并离心，借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出的乳酸脱氢酶活性，其水平反映效应细胞的杀伤活性。

（3）细胞凋亡检查法

效应细胞介导靶细胞凋亡时，内源性核酸水解酶将靶细胞DNA在核小体单位之间被切断，产生180～200bp（核小体单位长度）及其倍数的寡核苷酸片段，在琼脂糖电泳中呈现阶梯状DNA区带图谱，借此可反映细胞凋亡。

如需测定凋亡细胞数目及细胞类型，可在细胞培养物中加入末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase，TdT）和生物素标记的核苷酸，TdT能在游离的DNA 3’端缺口连接标记的核苷酸，利用亲合素-生物素-酶放大系统，在DNA断裂处显色，从而指示凋亡细胞。该法所用标记核苷酸多为dU TP，故称TUNEL法（TdT dependentdUTP-biotin nick en labelling)。

图10-26　Cr释放法细胞毒试验

3.分泌功能测定

检测免疫细胞所分泌细胞因子和抗体水平，可反映机体免疫能状态。

（1）细胞因子分泌细胞的测定

细胞因子分泌细胞的测定常采用反向溶血空斑试验（RHPA）和酶联免疫斑点试验（ELISPOT）。RHPA检测原理是:将分泌细胞因子的頛细胞置于经SPA包被的单层SRBC中，抗细胞因子抗体被SPA固定在SRBC表面，并与待测细胞所分泌细胞因子结合。在补体存在时，细胞因子及其抗体形成的复合物可激活补体，溶解附近的红细胞形成溶血空斑。空斑大小与细胞分泌细胞因子的量成正比。

（2）抗体形成细胞测定

抗体形成细胞测定常用溶血空斑试验和定量溶血分光光度测定法。

溶血空斑试验即测定常用溶血针对SRBC表面已知抗原的抗体形成细胞数目。其原理是:抗体形成细胞分泌的Ig与SRBC表面抗原结合，在补体参与下出现溶血反应。每一空斑中央含一个抗 体形成细胞，空斑数目即为抗体形成细胞数（图10-27）。亦可采用RHPA和ELISPOT法检测抗体分泌细胞。

定量溶血分光光度测定法原理:根据溶血空斑试验原理衍化而来。意气风发绵羊红细胞免疫小鼠后获得的脾细胞（含抗体形成细胞）与绵羊红细胞（SRBC）及豚鼠新鲜血清（补体）按一定比例混合，37℃水浴1小时，SRBC溶解，释放血红蛋白，离心后上清液中的血红蛋白可用分光光度计定量测定。所获上清液吸光值与抗体形成细胞（浆细胞）分泌的抗体量成正比。

（1）直接溶血空斑试验法:检测分泌IgM的抗体形成细胞（图10-28）。

（2）间接溶血空主试验法:检测分泌IgG或其他类别Ig的抗休形成细胞。

方法:前两步与直接法相同，第三步需加入抗IgG或其他抗抗体，再加豚鼠新鲜补体进行观察（图10-29）。

图10-27　溶血空斑试验

图10-28　直接溶血空斑试验作用机制示意图

图10-29　间接溶血空斑试验作用机制示意图