免疫金标记技术

氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称为胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机制可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径，也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。

免疫金标记技术（immunogold labelling techique）主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。

胶体金免疫结合试验的检测原理是以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金结合物达到检测目的。根据检测装置的不同可分为斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno-gold filtration assay，DIGFA）和金免疫层析试验（gold immune chromatography assay，GICA）。由于胶体金制备简单稳定，无需着色，且能与多种蛋白结合，因而DIGFA技术发展迅速。用于检测HBsAg、HCG、AFP和抗双链DNA抗体等，具有简单、快速、准确和无污染等优点。配合小型检测仪，可做半定量和定量检测。

目前，采用免疫金标记技术开发的POCT试验包括①激素：人绒毛膜促性腺激素（HCG）、促黄体生成激素（LH）和促卵泡成熟激素（FSH）；②传染病病原的抗原和抗体：甲型肝炎IgM抗体（抗-HAV IgM）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗体（抗-HBc IgM、抗-HBc IgG）、丙型肝炎抗体（抗-HCV）、艾滋病病毒抗体（抗-HIV）、肾病综合征出血热病毒抗体、乙型脑炎血清特异性抗体、传染性单核细胞症嗜酸性抗体、单纯疱疹病毒抗体、巨细胞病毒抗体、风疹病毒抗体、轮状病毒（粪便）、登革热病毒抗体、呼吸道合胞病毒（分泌物）和流感病毒A抗原（鼻咽部分泌物）等；③性病病原：梅毒螺旋体抗体、淋球菌（分泌物）和泌尿生殖系沙眼衣原体（分泌物）等；④细菌：结核杆菌抗体、A族乙型溶血性链球菌（喉拭标本）、沙门菌血清抗体和与慢性胃炎、幽门螺杆菌抗体等；⑤寄生虫：弓形虫抗体、包虫体抗体、血吸虫抗体、人囊虫病、恶性疟原虫循环抗原和间日疟原虫、班氏丝虫抗原及利什曼原虫抗原等；⑥肿瘤标志物：前列腺癌特异抗原（PSA）、癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）；⑦心血管病检测标志物：血清心肌钙蛋白、肌红蛋白和肌酸激酶同工酶；⑧其他蛋白质：大便隐血（FOB）、抗双链DNA抗体、C反应蛋白（CRP）、尿白蛋白、甲状腺微粒体抗体等；⑨其他：血糖、尿糖、苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡和海洛因等。

1．斑点金免疫渗滤测定法（dot immuno-gold filtration assay，DIGFA）　免疫渗滤试验（immuno filtration assay，IFA）始创于1985年，最初以酶作为标记物。1989年Du Pont公司推出了用于检测抗HIV抗体的金免疫渗滤试验DIGFA，确立了DIGFA的基本技术。

DIGFA试剂盒有两个主要成分（图1-5）：一是金标抗体结合物，另一是渗滤装置。该装置为一充满吸水垫料的塑料小盒，在盒盖中央的小孔下面放置了一片硝酸纤维素膜，膜上预包被抗原或抗体斑点。试验时将标本滴加在膜上，通过渗滤使抗原抗体在膜上发生免疫结合反应；再滴加金标结合物，使其与对应抗体抗原结合并显色。阳性结果在膜上出现着色斑点。DIGFA检测操作步骤与酶联免疫吸附试验（ELISA）法相同。差别在于加样、反应和洗涤均通过渗滤完成。检测全过程仅需数分钟，但敏感度却与需数小时完成的ELISA相仿。其原因在于：ELISA样品中的待检抗原需缓慢地扩散才能与吸附于固相表面的抗体反应，而在膜渗滤法中，抗体充满了膜的微孔，待检液体层层渗滤时抗原抗体紧密接触形成免疫浓缩，从而提高了反应效率。另外，以胶体金作为标记物，不但减少了操作步骤，而且试剂可在室温长期保存。此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病毒（HIV）的检查和人血清中甲胎蛋白（AFP）的检测。

图1-5　免疫渗滤试验渗滤操作、装置、结果判读

2．金免疫层析试验（gold immune chromatography assay，GICA）　1990年Oskiowicz等建立了ICA，其原理与DIGFA相同；不同点在于液体的移动不是通过直向的穿流（flow through），而是基于层析作用的横流（lateral flow）。Oskiowicz应用的标记物为胶体硒，其后一般均采用简便的胶体金，称为金免疫层析试验（GICA）。

GICA是将各种反应试剂以条带状固定在同一试纸条上（图1-6，图1-7），待检标本加在试纸条的一端，将一种试剂溶解后，通过毛细作用在层析条上渗滤、移行并与膜上另一种试剂接触，样品中的待测物同层析材料上针对待测物的受体（如抗原或抗体）发生特异性免疫反应。层析过程中免疫复合物被截留、聚集在层析材料的一定区域（检测带），通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。GICA特点是单一试剂，一步操作，全部试剂可在室温长期保存。

图1-6　免疫层析法检测结构示意图

图1-7　免疫层析法检测结果

GICA试剂结构简单，小型实验室即有条件开发生产。近年来发展生产GICA试剂的单位如雨后春笋般，目前试剂的品种已多达数十种，测定项目包括HCG、LH等激素，肿瘤标志物，传染病的抗原和抗体，心血管病标志物等，性病、毒品的检测等。