具体涉及的实验方法

1．DNA的提取及浓度测定

羊组织基因组DNA提取使用Axygen动物组织基因组DNA小量制备试剂盒提取。

（1）将20mg羊肝组织与匀浆磁珠放入匀质管中，加入600μL PBS和0.9μL RNase，放入快速生物样品匀质器10000×g30s，直至研磨完全。

（2）转移350μL匀浆到2m L离心管中，加入150μL Buffer C-L和20μL Proteinase K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置于56℃水浴10min。

（3）加入350μL Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12，000×g离心10min。

（4）将步骤3中的滤液转移至带有滤管的2ml离心管中，12，000×g离心1min。

（5）倒出滤液，继续向滤管中加700µL buffer W1A，室温放置2min 12，000×g离心30s。

（6）倒出滤液，再加800µL已加无水乙醇的buffer W2，12，000×g离心1min。

（7）弃滤液，将制备管置回原2m L离心管，12，000×g离心1min。

（8）倒出滤液，将滤管转移至一新的1.5m L离心管中，在制备管膜中央加200µL buffer TE，室温静止2min。12，000×g离心1min洗脱基因组DNA。

得到的DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测以确保DNA的完整性。－20℃冰箱中保存。

DNA浓度、纯度测定：

取2-10μL提取出的DNA，用灭菌蒸馏水稀释100～500倍，用紫外分光光度计分别测定260nm和280nm的OD值。DNA浓度（μg/m L）=ODvalue×50×dilutiontime；DNA纯度=OD260/OD280value。比值在1.6-1.8之间时说明DNA纯度较高，若比值小于1.6，则应纯化去除蛋白质；若比值大于1.8，则应进行RNA纯化。

2．组织样品RNA的提取（Trizol法）

（1）匀浆：取1000µL的Trizol到已编号的离心管中，冰上备用。预冷研钵，取出样品记录后用消毒过的剪子剪成小块，加入液氮进行研磨，样品取样量为50-100mg，在装有液氮生物研钵中研磨成粉末状，用预冷过干净的小勺或者枪头转移至Trizol中，充分摇匀，室温裂解5min以上。

（2）分相：向（1）中加入200µL的氯仿，漩涡振荡器振荡至液体完全混匀，放在通风橱中静置10min，然后4℃12000×g离心15min。

（3）沉淀：将离心后的上清分几次小心的转移到已编好号的离心管中，加入500µL的异丙醇，翻到混匀，通风橱内静置10min，4℃12000×g。

（4）洗涤：小心倒掉上清，加入1000µL冰冷的乙醇，不断震荡使沉淀悬浮。4℃8000×g离心6min，倒掉乙醇，注意沉淀，扣在滤纸上吸干，通风橱内干燥10min。

（5）溶解：在冰上加入20µL的DEPC水，充分混匀溶解后，测浓度及OD值，取2μL 进行电泳检测，-80℃保存。

（6）总RNA电泳检测和OD值测量

将5μL RNA样品和1μL 6×Loading Buffer混匀后点样于1%琼脂糖凝胶中，使用1×TAE缓冲液，120V电压进行电泳，20min后将琼脂糖凝胶置于紫外灯下观测结果并拍照记录。另取1μL RNA样品使用Quawell Q5000超微量紫外分光光度计进行OD值测量并记录，以确定总RNA样品的纯度与浓度。

3．基因c DNA序列的克隆

（1）基因c DNA序列的克隆引物设计

根据Genbank中已发表的羊的**基因的序列信息，通过序列比对，以公共序列为靶序列，用Primer6软件设计得到上下游引物（F1、R1），扩增后获得**基因部分CDS区。再由得到的CDS区序列设计5’RACE反转录引物，PCR引物，以及3’RACE引物。

（2）5’端第一链c DNA的合成

表3-2 5’端第一链c DNA的合成

混匀后瞬时离心。

55℃孵育60min，85℃5min，-20℃储存。

（3）5’端c DNA的纯化

①向20µL c DNA中加入100µL Bindingbuffer后混匀。

②将液体移入收集制备管中，8000×g离心30s。

③倒出液体后向离心管中加入500µL Wash Buffer，8000×g瞬时离心30s。

④弃去液体，再加入200µL Wash Buffer，15000×g瞬时离心2min。

⑤弃去液体后加入50µL Elution Buffer，8000×g瞬时离心30s。-20℃保存。

（4）第一链c DNA加尾

利用末端重组转换酶和d ATP在反转录后的c DNA3’端加上ploy A尾巴。以下反应均在冰上进行。

表3-3 第一链c DNA加尾体系

混匀后瞬时离心。

94℃孵育3min后置于冰上。

加1µL Terminal Transferase后混匀，37℃孵育20min，70℃10min使酶失活。

（5）5’端序列PCR扩增

将已纯化并加尾的c DNA样品置于冰盒之上，PCR反应体系中各溶液置于冰盒之上缓慢融化。将PCR管置于冰上，参照下表PCR体系，依次加入，最后成为50µL体系。

表3-4 5’端序列PCR扩增

将PCR管放入PCR仪中，94℃预变性4min；94℃变性15s；70℃退火30s；70℃延伸40s，从第二步开始10个循环；95℃变性15s；68℃退火30s；70℃延伸40s，从第五步开始25个循环并每个循环延伸时间增加20s；72℃延伸7min；4℃保存。所得PCR产物进行电泳检测是否有目的条带。

（6）3’端第一链c DNA的合成

表3-5 3’端第一链c DNA的合成

混匀后瞬时离心。

55℃孵育60min，85℃5min，可-20℃储存。

（7）3’端序列PCR扩增

将c DNA样品置于冰盒之上，PCR反应体系中各溶液置于冰盒之上缓慢融化。将PCR管置于冰上，参照下表PCR体系，依次加入，最后成为50µL体系。

表3-6 3’端序列PCR扩增

将PCR管放入PCR仪中，94℃预变性4min；94℃变性15s；70℃退火30s；70℃延伸40s，从第二步开始10个循环；95℃变性15s；68℃退火30s；70℃延伸40s，从第五步开始25个循环并每个循环延伸时间增加20s；72℃延伸7min；4℃保存。所得PCR产物进行电泳检测是否有目的条带。

（8）目的片段的克隆与序列测定

目的DNA片段的克隆测序过程包括：大肠杆菌感受态细胞的制备、Amp+LB培养基的配备、PCR产物的回收、回收产物的连接、转化、阳性菌液的培养、测序。

①产物的回收纯化

取每个样品的PCR产物50µL，进行1%琼脂糖凝胶电泳。电压为100V，电泳约30min后进行回收。

A．首先称量离心管重量，记录后在紫外光照射下按照目的片段边缘将凝胶切下，尽量去除多余部分。将凝胶块放入离心管中，再次称量，两次差值为凝胶重。按照比例换算。设凝胶体积为A

B．向凝胶中加入3Aml的buffer DE-A，使凝胶完全没入液体中后，放到65℃水浴锅中融化至凝胶完全消失。然后再加热两分钟左右。

C．从水浴锅中取出后再向离心管中加入1.5Am L buffer DE-B，混合均匀。

D．转移3中的黄色液体到试剂盒中所提供的滤管放入2m L的离心管中， 12，000×g离心1min。倒掉液体。

E．向滤管中加入500µL buffer W1，10000×g离心1min。倒掉液体。

F．向滤管中加700µL buffer W2，10000×g离心1min。倒掉液体。按照相同的方法再一次清洗。

G．倒出液体后再放回离心机12000×g离心1min。

H．将滤管转移至新的1.5m L离心管中，在滤管中加25µL Eluent，室温静止2min。12000×g离心1min洗脱DNA。（将Eluent加热至65℃提高洗脱效率）

②感受态的制备

A．在无菌操作台中，用牙签挑取储存于-80℃冰箱中的DH5α菌种，均匀涂抹于无抗LB固体培养基上，37℃培养箱中倒置过夜。

B．用牙签挑取一个已复苏的DH5α单菌落转移至装有5m L LB液体培养基中， 37℃下振荡培养12h左右。

C．取1m L该菌液加到100m L LB液体培养基中放入37℃摇床中剧烈振荡培养2-3h，2500r/min，每隔30min取出测量OD值来监测菌体的生长情况。

D．当菌液的OD值在0.4-0.6之间时，在通风橱中，将菌液转移到两个无菌预冷过的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至0℃。

E．4℃条件下，4000rmp/min离心10min，以回收菌体。

F．弃去培养液，将管倒置于滤纸上吸去试管中残留的少量培养液。

G．用10ml冰冷的0.1mol/L Ca Cl2重悬沉淀，在冰上放置5min，4℃4000r/min离心10min，回收细胞。

H．弃去培养液，将管倒置于滤纸上吸去试管中残留的少量培养液。

I．用2m L预冷的1mol/L Ca Cl2重悬每份沉淀，加入灭菌甘油，甘油的终浓度为15%，混匀。

J．用移液器分装，每管120µL，冻存于-80℃冰箱中。

③连接反应体系

表3-7 连接反应体系

16℃ 30min。

④转化

A．LB平板37℃预热。

B．从冰箱中取出，并在冰上融化感受态细胞，取30µL感受态细胞加入5µL连接反应物，用移液器混匀，冰浴30min。

C．将混合液转移到42℃的水浴中，加热1min30s，注意不能摇晃。

D．时间到后迅速将离心管取出放回冰上，2min。

E．在无菌操作台中取800µL LB培养基加入细胞混合液中，然后37℃摇床摇匀45min。

F．离心4000rmp，4min，去上清液，留约200µL。充分混匀，然后用灭菌后的玻璃棒均匀涂抹于预热的LB固体培养基平板。

G．在无菌台中放置，观察菌液的吸收情况。

H．完全吸收后，倒置平皿于37℃培养箱中培养过夜。

⑤重组质粒菌体PCR鉴定

利用通用引物M13以菌体DNA为模板，进行菌落PCR，所得条带长度为载体中插入的目的片段长度。

表3-8 菌落PCR鉴定体系

A．在无菌台中，取800µL Amp+抗性的LB液体培养基到1.5ml的离心管中，用牙签挑取转化板上的大小适中单克隆的菌体，挑过菌体的牙签放到LB培养基中。

B．将带有菌液的LB培养基，放到摇床中，37℃，230r/min条件下摇菌。

C．摇至培养基浑浊，大约5h后，取0.5µL菌液进行PCR检测。

D．挑取PCR检测结果为阳性的单克隆菌液送测序公司进行测序。

4．基因表达验证（荧光定量PCR）

（1）组织总RNA的提取

Trizol法提取RNA。

（2）反转录

将反转录试剂放在冰上融化，按照下表加入各组分，根据测量得到的RNA样品浓度来确定加入RNA的体积，加入1µg RNA，最后用DECP处理过的水补齐至5µL。

表3-9 第一链c DNA的合成1

①按照以下组分将液体混合。

②70℃5min立刻放入冰中5min，离心10s，冰上放置。

③将以下试剂混好，置于冰上。

表3-10 第一链c DNA的合成2

④将15µl混合物加到①中的5µl中。

⑤25℃退火5min。

⑥42℃延伸一个小时。c DNA反应到这一步可以停止，长期储存。

⑦灭活反转录酶，70℃15min。

⑧-20℃保存。

（3）荧光定量PCR引物设计

根据预验证基因序列及已知的β-actin（GAPDH）基因序列，用Primer6软件进行引物设计。设计得到的引物和内参序列。

（4）荧光定量PCR反应体系及条件

表3-11 PCR体系

PCR反应条件为：95℃5min，95℃10s，60℃10s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃5s，65℃1min，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到97℃，最后温度降到40℃。

（5）定量分析

使用Roche480软件进行定量分析。

5．基因分型

（1）利用高分辨率溶解曲线（HRM）技术对待检测基因进行分型，将DNA稀释到50ng/µL，具体反应体系如下表。

表3-12 HRM反应体系

PCR反应条件为：95℃10min，95℃10s，退火15s，72℃20s，从第二步开始45个循环。95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后温度以5℃/s的速率从65℃递增到95℃，最后温度降到40℃。

反应结束后根据曲线的差异进行分型。

（2）PCR反应体系及条件

根据HRM分型结果进行PCR扩增，具体反应体系如下表。

表3-13 PCR体系

将PCR管置于PCR仪中，设定反应条件为95℃预变性4min；95℃变性40s；退火30s；70℃延伸30s，从第二步开始35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）目的片段的克隆与序列测定

同前文所述。

6．PCR-SSCP

PCR及PCR产物检测见前文实验方法。SSCP方法如下：

（1）电泳装置的准备

首先准备好垂直电泳槽、制胶用玻璃板、梳子、夹条、若干铁夹、电泳仪，将用于制胶的玻璃板、夹条及梳子浸泡在装有清水的盆中，水面要超过玻璃板、夹条及梳子，加入洗涤剂浸泡半个小时后，用海绵刷洗器具至少3遍，操作时应戴塑料手套，主要防止洗涤剂对皮肤造成伤害，其次也可避免手上的油渍对器具造成污染，刷洗干净后用自来水冲洗2-3遍，再用去离子水冲洗3遍后放置在玻璃板架上晾干。

制备胶床：首先将无耳的玻璃板平放在桌上，在其三个边缘放好对应的夹条，然后将带耳的玻璃板放在其上面，务必使两块玻璃板对齐。为了确保形成的胶床在灌胶时不出现漏胶的现象，可用胶带纸将夹条的三个边缘封好后，再用铁夹均匀固定好。

（2）8%聚丙烯酰胺凝胶的制备

表3-14 8%聚丙烯酰胺凝胶的制备

按上表的方法配制好凝胶溶液，并按以下方法灌胶：

①将8%聚丙烯酰胺凝胶混匀后马上灌胶，灌胶时玻板倾斜45°，缓慢倒入，在距离玻璃板上沿约1cm时停止灌胶，插入梳子后用移液器将胶补满，注意在灌胶的过程中不要产生气泡，一旦出现气泡可轻轻敲击气泡下部的玻璃板，向上驱逐气泡。

②将胶床倾斜10°左右放置，在室温下放置约1h左右，当梳齿下出现Schlieren线时，表示凝胶聚合完全，所谓Schlieren线是由于光线通过不同密度不同折射率的透明介质折射所产生的波纹。

③胶凝好后，去掉胶带纸及底部的夹条，带耳一侧的玻璃板上端与电泳槽顶部的胶条相贴，用铁夹固定好，在电泳槽的上下两槽加入1×TBE缓冲液。

④拔掉梳子，拔梳子时两手用力要均匀，速度要平缓，以保证加样孔平直。然后用上样器冲洗加样孔，以免加样孔中残留未聚合的丙烯酰胺再次聚合，从而可能导致加样孔底形状不整齐造成电泳后的带型不整齐。

⑤在配胶过程中如果想缩短凝胶聚合的时间，可适量多加入过硫酸铵和TEMED，但不要过量，固定玻璃板和电泳槽的夹子一定要夹紧，防止漏液。

（3）电泳

首先将固定好的电泳槽顶部接负极，底部接正极进行预电泳，预电泳时间保持10min以上，电压为150V，预电泳的目的是打通凝胶，去除凝胶中没有聚合的单体和双体以及聚合引发剂，以提高分辨率。

取PCR产物2μL和上样缓冲液5μL置于PCR管中，离心混匀，98℃变性10min，迅速冰浴10min，使之保持变性状态，停止预电泳，然后用上样器开始加样，加样时针头不要刺破加样孔侧壁的凝胶，并且此过程中不要产生气泡；加样完毕后，将电泳槽放置于4℃冰箱中，150V电压下电泳10h～14h（垂直电泳一定要在恒低温的状态下进行）。

（4）染色及结果观察

电泳结束后取下胶床，移去一侧玻璃板，动作要轻，一定要避免凝胶撕裂，使凝胶贴在另一块玻璃板上，小心分离凝胶将其移入托盘中。

①固定：在托盘中加入10%的乙醇250m L，置于水浴振荡器上缓慢摇动，固定10min后倒掉固定液，用去离子水洗胶2次，每次1-2min；

②氧化：用1%的硝酸250m L氧化3min，倒掉硝酸，用去离子水洗胶2次，每次1-2min；

③染色：用0.1%的硝酸银250m L染色30min，倒掉硝酸银，用去离子水洗胶2次，每次1-2min；

④显色：用2%的碳酸钠甲醛溶液250m L进行显色（2%碳酸钠：甲醛=500m L：1m L），当电泳条带充分显现后终止显色，用去离子水洗胶2次，每次1-2min；

⑤终止：加入4%的醋酸250m L终止显色，加入终止液之后缓慢晃动几分钟（大概5min左右）；

⑥水洗：倒掉终止液加入蒸馏水洗胶2次，每次1-2min；

⑦记录显色结果，将胶放在成像仪上进行拍照、分型，之后可封存于保鲜膜存放于4℃冰箱中。

7．PCR-RFLP

根据序列比对分析结果，寻找可进行限制性内切酶酶切的位点，建立酶切体系：10×Buffer2.0μL，PCR产物10.0μL，BSA0.2μL，限制性内切酶（10 U/μL） 0.5μL，dd H2O7.3μL，总体积20.0μL。于37 ℃过夜消化后进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，拍照记录并统计基因型。

8．数据统计与分析

（1）基因频率

基因频率是指在一个种群基因库中，某个基因占全部等位基因数的比率，其计算公式为：

Pi=［2（ij）+（ij1）+…+（ijn）］/2N

式中，Pi为第i个等位基因的基因频率；i为纯合复等位基因；j1…jn为与i共显的第1到第n个等位基因。

（2）基因型频率

基因型频率是指在一个种群中某种基因型的所占的百分比。其计算公式为：

基因型频率=基因型个体数/测定群体总数

（3）Hardy-Weinberg平衡检验

Hardy-Weinberg定律是指：在理想状态下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在遗传中是稳定不变的，即保持着基因平衡。其平衡状态的检验可使用以下公式：

式中，m为某遗传位点基因型应有个数；i则为基因型序号；fi代表第i个基因型实际个体数量；n则为样本数量；pi代表第i个基因型理论频率。

（4）基因纯合度（Ho）和基因杂合度（He）

基因纯合度是指群体在标记基因处为纯合子的比率，基因杂合度是指群体在标记基因处为杂合子的比率。其计算公式为：

式中，i为第i个等位基因；Pi为等位基因频率；n则为等位基因数。

（5）有效等位基因数（Ne）

有效等位基因数是指一个基因座上产生与实际群体中相同的纯合度所需的等位基因数，它等于实际群体的纯合度的倒数。其计算公式为：

式中Pi为群体内第i个等位基因频率，n则为等位基因数。

（6）多态信息含量（PIC）

多态信息含量是指一个后代所获得某个等位标记来自于它的父亲（或母亲）的同一个等位标记的可能性。其计算公式为：

式中Pi、Pj分别为群体内第i、j个等位基因频率，n则为等位基因数。

（7）遗传均质度（H.I.）

均质度是反映群体的遗传纯度的一个重要指标。均质度越大，群体的一致性越高、遗传变异越小。

pi：第i个位点等位基因频率，m：等位基因数。

（8）Nei氏遗传同质度和遗传距离

遗传同质性是指不同种群之间在遗传结构上的相似程度。遗传相似性越大则表明种群间有可能在进化上具有较近的亲缘关系。遗传距离是用基因频率的函数表示的群体间遗传差异。它的最适宜的测度应该是单位长度DNA的核苷酸数或密码子的差数。根据遗传距离大小可以确定品种（群体）间亲缘关系的远近，为杂交利用提供最佳组合方式。

遗传距离与遗传同质性的关系：Ds=-ln（I）

遗传同质性的公式：I=Jxy（JxJy）-1/2

公式中D为标准遗传距离，I为两个群体间的遗传同质性，Xij、Yij分别是x、y群体中第j个位点上第i个等位基因的频率，r为基因位点数，mj为第j个位点上等位基因个数。

（9）杂种优势率

从遗传学研究可知，两个有差异的品种（或种群）杂交时一般都能产生杂种优势，即杂种群体表现为超过两个亲本的平均水平，甚至优于双亲中的任何一个亲本。产生杂种优势的遗传基础是两个亲本群体中显性有利基因的互补，增加了基因相互作用的机会。杂交后代中，不同性状的杂种优势不同。一般认为低遗传力性状的杂种优势高，高遗传力性状的杂种优势低。

杂种优势率的计算：

H（%）＝（F1－P）/P

公式中H为优势率，F1为杂交一代相关性状均值，P为双亲相关性状均值。

（10）基因多态性与生产性状的关联性分析

根据影响肉羊肉质性状的因素并考虑到年龄和遗传效应，进行关联性分析时采用了以下固定模型：Yij=μ+markerj+eij

其中：Yij：个体表型的记录值；μ：群体平均值；markerj：标记基因型效应；eij：随机误差。使用SPSS 20.0软件对各基因型间肉质性状指标（平均值±标准差）进行差异显著性检验。

9．绵羊前脂肪细胞的分离与培养

（1）绵羊前脂肪细胞的分离

①取绵羊皮下脂肪组织，在超净台中剪碎。

②将剪碎的脂肪组织放入10ml离心管中，加入0.1%胶原酶Ⅰ，37℃水浴1h，期间不断摇晃，使脂肪块尽量分散。

③分别用100目、150目滤网过滤，收集过滤液，弃网上残渣。

④对过滤液进行离心，2000rmp，离心5min。

⑤加入完全培养基，悬浮细胞，将细胞悬浮液转移至新的培养皿中。

⑥5%CO237℃培养，每48h换液一次。

（2）绵羊前脂肪细胞的复苏与冻存

细胞的复苏：

①将细胞冻存管从液氮罐中取出，立即投入37℃灭菌双蒸水中融化2-3min。

②将冻存管中液体全部转移至1.5m L离心管中，2000rmp离心5min，弃去上清。

③向每个离心管分别中加入1m L完全培养基，反复吹打细胞，悬浮细胞。

④将细胞悬液转移至新的培养皿中培养，加入适量完全培养基，并且标记好细胞种类及复苏日期。5%CO237℃培养。

⑤每48h换液一次，待细胞贴壁后变为梭形且融合度达到80%以上时，可进行冻存，传代或其他后续实验。

细胞的冻存：

①冻存前一天为细胞更换培养液。

②从培养箱中取出细胞培养皿，弃去培养液，加入PBS洗涤细胞，弃去洗涤液，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化细胞3min，加入1m L完全培养基，吹打细胞，使细胞脱落，将液体转移至1.5m L离心管，2000rmp离心5min。

③小心弃去上清，加入冻存液吹打混匀后转入冻存管，封好，标记细胞种类及日期。

④放入4℃冰箱中，2h后转移至泡沫箱中，再放入-80℃冰箱中缓慢降温。

⑤-80℃过夜，取出，液氮中保存。

（3）绵羊前脂肪细胞的传代

①待细胞融合至80%以上时可以开始传代，从冰箱中取出完全培养基和PBS放入37℃水浴中预热。在超净台中用移液器将培养皿中的液体吸干净，期间注意最好不要碰到细胞。

②向培养皿中加入1m L预热过的PBS，轻轻摇动培养皿，悬浮死细胞，然后吸出培养皿中液体，此过程可以重复一次。

③然后分别向每个孔中加入1m L胰蛋白酶，超净台中室温放置3min，期间不断在显微镜下观察细胞形态，细胞逐渐变圆，随后用移液器将胰蛋白酶吸出，注意不要碰到细胞。

④接着分别向每个孔中加入1m L完全培养基，小心吹打，注意不要吹出气泡，使培养皿壁上细胞完全脱落后，将液体按密度比例平分到新的孔中，继续在培养箱中培养。

10．G418对绵羊前脂肪细胞的毒性试验

在超净台中将绵羊前体脂肪细胞用胰蛋白酶消化后，平分至一个洁净的6孔细胞培养板中，然后再用DMEM-F12（10％血清，无双抗）空白培养基补齐至2m L，然后放置在培养箱中培养过夜，使用显微镜观察细胞贴壁，并且融合度达到90％后，更换含有G418的培养基继续培养，（G418筛选浓度分别为200μg/m L、400μg/m L、600μg/m L、800μg/m L和1000μg/m L），每48h换液1次，连续观察12d，并记录。最后选取加入G418后细胞完全死亡的G418最低浓度为G418对绵羊前体脂肪细胞的最佳筛选浓度。

11．基因过表达载体的构建与验证

（1）引物设计

（2）基因扩增、回收

（3）胶回收产物及pc DNA3.1载体酶切纯化

（4）连接反应

（5）目的条带鉴定

按照前述方法进行转化反应及菌落PCR鉴定后送生物公司测序。

（6）质粒的提取（试剂盒法）

将测序结果正确的剩余菌液移入试管中加入5m L含有双抗的LB液体培养基中。在37℃，230r/min条件下摇菌5h以上。

①取4m L菌液分两次用2m L离心管12，000×g离心1min，弃去上清。

②向离心管中加入250µL Buffer S1使沉淀悬浮在液体中。

③再加入250µL Buffer S2与S1混合，颠倒混匀，使悬浮的菌体完全溶解在溶液中，直到液体完全澄清。

④随后向离心管中加入350µL S3，再次充分混合均匀，12000×g离心10min。

⑤将步骤4中的液体加入到滤管中，12000×g离心1min.

⑥倒掉滤液，接着向离心管中加500µL Buffer W112000×g离心1min。

⑦倒掉滤液，向离心管中加700µL Buffer W2，12000×g离心1min。以同样的方法再洗涤一次。

⑧倒掉滤液，再次12，000×g离心1min。将液体离心干净。

⑨倒掉滤液，将滤管放入新的干净的1.5m L离心管中，在制备管膜中央加60µL Eluent，室温静止1min。12，000×g离心1min洗脱。

（7）基因过表达载体的转染

转染前一天，将绵羊前脂肪细胞传代至一个新的6孔培养皿中，放入培养箱中培养使细胞融合至90%。使用脂质体转染法将基因过表达载体转染至绵羊前脂肪细胞，具体方法如下：

①在超净台中，将20µL Lip3000与500µL Opti-MEM培养基混匀。

②取4个高压灭菌后的1.5m L离心管，分别加入5µL对应的载体质粒和125µL Opti-MEM培养基，再分别向4个管中加入5µL P3000混匀。

③从①中取混合液130µL分别加入到②中的4个离心管中，混匀室温静置5min。

④静置期间，进行一次细胞换液，用PBS溶液清洗两遍后，加入完全培养基。

⑤最后，将步骤③中的混合液用移液器缓慢均匀地加入对应的细胞培养皿中，轻轻晃动培养皿，使转染液与培养液混合均匀。标记好后放入5%CO237℃培养箱中培养，期间使用显微镜进行观察，待细胞贴壁并融合后更换G418培养基继续培养。

（8）RT-PCR检测基因m RNA水平表达

用含有G418的完全培养基筛选10d以后，待细胞长满，弃去培养基，用PBS清洗2遍，洗去死细胞，在超净台中分别向每个培养皿中加入1m L Trizol，显微镜下观察，细胞裂解后，用移液器将液体移入高压过的1.5m L的离心管中，按照Trizol法进行细胞RNA的提取并检测。按照反转录步骤将提取得到的细胞RNA反转录得到c DNA，接着进行RT-PCR检测。反应结束后，记录各个组分及内参基因的ct值，并进行统计分析。

（9）甘油三酯检测

①将细胞用PBS清洗2次，用胰蛋白酶消化后，吹打脱落，5000×g离心1min，收集细胞后加入200µL裂解液，混匀后室温静置10min。

②配置甘油标准品标准液，按照250、500、1000、2000、3000、4000Mm/µL稀释甘油标准品。

③将静置后的细胞裂解液上清转移至新的离心管中，70℃10min，然后2000rmp，5min取上清。

④配制工作液将R1与R2以4∶1的比例混合，工作液应现用现配，放置时间不宜超过两小时。

⑤取200µL离心管，将细胞裂解液与工作液以1∶19的比例混合后，稀释的甘油标准品也一起按照同样比例混合，放入37℃培养箱10min。

⑥取出后用可见光分光光度计检测吸光值。颜色在1h内稳定。

（10）基因RNAi载体的构建与验证

根据sh RNA的设计原则，设计sh RNA后送公司合成，连接干扰空载体PGPU6/GFP/NEO构建绵羊基因的RNAi载体。

将干扰载体分别转染至绵羊前脂肪细胞，然后提取细胞RNA根据基因的m RNA的表达水平，筛选出干扰效果最好的sh RNA。最后对RNA干扰后的细胞进行甘油三酯检测。

12．主要互联网资源与分子生物学软件

实验分析中使用的网络资源和分子生物学相关软件见下表3-15。

表3-15 主要互联网资源与分子生物学软件

13．研究中的注意事项

（1）关于肌肉组织的采集与保存

大型家畜动物的肉样单独采集具有一定的难度，因此本试验中的所用的肌肉组织选择在同一批肉羊进行大规模屠宰时进行。在采集前提前准备好洁净的锡纸并裁成每边10cm的方块状，在背面用记号笔标记上采集的日期、对应羊的编号及采样部位，防止混淆样品。为了保证肉样的新鲜程度并减缓RNA的降解，在采集时携带了小型的液氮罐备用。将刚屠宰后采集到的大块肉样立即用消过毒的剪刀分割成数份1g左右的小块，各自用锡纸包装好后装入有标签的布袋内，再置于小型液氮罐中。回到实验室后，立即将样品转入大型液氮罐并做好标记。为了防止液氮流失影响样品的保存效果，还要注意定期向液氮罐内注入液氮。在使用液氮罐时，要注意通风，戴好手套，小心轻放，盖子要及时盖严。

（2）肌肉组织内总RNA的提取

目前，已经有多种RNA提取方法被发明，并据此开发出各种RNA提取试剂盒，但由于试验样品中常含有RNA酶、多酚、多糖等物质降解RNA或与其形成难溶物影响到RNA的提取，导致试验难以成功。根据本试验的实际情况，选择用Trizol法来提取肌肉组织内总RNA。在经历了数次提取过程后，总结出以下几点经验：

①提取RNA所用组织样本要尽量新鲜，在其被采集后要尽快包装好置于液氮中保存，减少与空气的接触，以减缓RNA的降解速度。样本采集后最好当天就进行RNA的提取，这样效果最好，否则必须一直保存于液氮中。

②在RNA提取前，要将实验中所用到的剪刀、研钵、离心管等用DEPC水处理并烘干，以尽量除去RNA酶。在实验操作过程中要戴着一次性PE手套与口罩，尽量不与他人交谈，避免自身携带的RNA酶污染样本。

③在研磨组织样本时，要先把研钵用液氮预冷，再进行研磨，并注意及时向研钵中补充液氮，研磨的时间要尽量快且保证样本颗粒足够细。为了使样本颗粒与Trizol试剂充分接触与溶解，可先将Trizol试剂直接加到刚研磨完的研钵中溶解样本颗粒，再用移液枪将溶液吸到离心管中，这样可以提高RNA的提取量。

④在加入三氯甲烷并离心分相后，需要将上清移入新的离心管，在吸液时要注意使枪头尽量稳定在上清层，避免与分界处的膜接触，吸取量不能贪多，300μL即可，吸的过多反而会导致提取的RNA纯度降低。

（3）关于PCR引物的设计

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是目前分子生物学相关研究中最广泛、最常用的技术之一，也是一个非常敏感的指数扩增过程，主要受到引物、反应体系、模板、温度、时间等因素的影响，条件稍有差异就可能会导致扩增失败。其中，好的PCR引物设计是扩增反应成功的重要前提之一。引物设计的好，其与模板链的特异性结合就会更紧密，能显著提高PCR产物的特异性与反应效率，减少非特异性的扩增。通过参考其他相关文献并结合本试验引物设计实际操作，总结出以下几点经验：

①引物的长度应在18bp-27bp之间，如果过长就会导致延伸温度过高，不利于Taq DNA聚合酶参与反应，影响PCR反应效率。另外，引物中的碱基应尽量随机分布，减少嘧啶和嘌呤的堆积。

②引物3'端的最后一位碱基对扩增效率有很大的影响。研究发现，不同的末位碱基导致的错配效率并不一样，其中末位碱基为A时错配率显著高于T、C、G碱基，因此应避免引物的3'端末位为碱基A。另外，引物自身的二聚体及发夹结构也可能会导致扩增反应的失败。

③引物序列中的GC含量应尽量保持在40%-60%，过高或过低的GC含量都不利于扩增反应进行。另外，上下游引物各自的GC含量不应相差过大。

④引物序列在PCR模板内尽量没有相似性高的序列，特别是与3'端相似性高的序列，否则就容易导致错配发生。另外，如果引物的3'端出现3个以上的连续碱基，也会导致错配机率增加。

⑤要避免形成发夹结构和引物二聚体的能值过高（大于4.5kcal/mol），这两种情况会导致引物二聚体条带的产生，降低引物的浓度并影响PCR反应的正常进行，且对PCR产物的观察与测序造成影响。

⑥∆G值是指DNA双链结合时所需要的自由能，它对应着双链结构中碱基对间的连接稳定性。在设计时应当选择3'端∆G值偏低（绝对值不大与9），而5'端与中间∆G值较高的引物。如果引物的3'端∆G值过高，就可能会错误地形成双链结构并导致错配发生。

⑦引物的3'端的最后一位碱基应尽量处于一个密码子的前两个核苷酸处，这是因为密码子的第3位容易发生简并现象，影响到PCR扩增的效率与特异性。

⑧在使用软件设计时，一般情况下软件会给出多条参考引物供选择，为了节省试验时间，可以考虑将其中分数排名靠前的数对引物同时送往生物公司合成，避免因某对引物不合适而浪费时间。

（4）关于RT-PCR与梯度PCR

RT-PCR（reversetranscription PCR）即逆转录PCR或反转录PCR，它是一种特殊的PCR技术，已得到广泛应用。在RT-PCR过程中，RNA单链被反转录为与其互补的c DNA第一链，以c DNA第一链为模板进行常规PCR即可得到完整的DNA双链。RT-PCR可大致分为两种，其中一步法较简单、方便，但对本试验来说，使用两步法RT-PCR，可保证试验的每一步都是在最佳的条件下进行，更容易控制与摸索反应条件，效果更好。本试验中的RT-PCR步骤主要是使用反转录试剂盒进行扩增，非常方便。实验过程中有两点需要注意：配置反应体系时尽量在冰上操作，避免反转录酶失活；对有复杂二级结构的RNA模板，可在加入模板和引物后将其置于70℃水浴10min，再冰浴5min以打开其二级结构，然后继续实验。

为了找到扩增目的基因的最佳退火温度，采用了梯度PCR的方法。梯度PCR能够实现在不同的退火温度同时进行热循环，通过一次PCR扩增就能确定扩增体系对应的最佳退火温度，从而在短时间内对PCR反应条件进行优化，极大地提高了试验效率。在本试验中，根据引物设计软件提供的参考退火温度，将PCR的退火温度梯度设计为从参考温度+5℃到-2℃的8个梯度，同时进行扩增，通过观察各梯度的PCR产物凝胶电泳图像来确定最佳退火温度。总的来说，这是一种非常省时省力的PCR方法，可在以后的分子试验中继续使用。

（5）关于PCR产物的克隆

为了保证连接的顺利进行，需要先得到高质量的凝胶回收纯化的目的条带。在切胶回收时，要注意以下几点：

①琼脂糖凝胶要尽量做的薄一些，以减少琼脂糖在所切凝胶块中的比例，并使用宽的梳子，以增加上样量，提高回收的DNA量。

②在切胶时速度要尽可能快，以减少DNA在紫外灯下曝光的时间，避免对测序结果造成影响。

③在最后的离心步骤中，提前将洗脱液预热，并将得到的滤液加回到收集管内，再离心收集一次，这样可以提高DNA的回收量，减少损耗。

由于本试验中对PCR产物进行克隆的目的是进行测序，所以选用了实验室保存的DH5α大肠杆菌与宝生物公司的p MD18-T载体。在制备感受态细胞及进行连接、转化的过程中，都需要在超净无菌工作台上进行操作，以免受到杂菌污染，影响实验结果。

连接产物的转化率取决于细菌转化质粒的能力和细菌的总数量，随着大肠杆菌在液体培养基内繁殖生长，单位体积内的菌体数目会增加，但单个菌体转化质粒的能力却会因生长过度而下降。因此，将大肠杆菌的密度控制在合适的范围内对制成的感受态细胞转化能力具有重要影响。对于DH5α大肠杆菌来说，当OD值为0.4左右时，细菌处于对数期中期，是最合适的生长状态。大肠杆菌在该时期的生命力较强，被诱导后处于感受态的菌体数量较多，同时细菌耐冷和冷冻保存引起的物理损伤的能力也较强，因此能获得比较高的转化率。在制备感受态细胞时，要注意提前将Ca Cl2、甘油等预冷，整个操作过程最好都在冰上进行，以保持感受态细胞的活力。在进行了数次转化实验后，可明显发现新制作的感受态细胞处于刚解冻的状态时转化效果最好，阳性克隆数目较多。

在筛选含有目的基因片段的阳性克隆的几种方法中，抽提质粒DNA，再用相应的限制性内切酶进行酶切鉴定确实是最准确的方法，但其所需时间多，成本高，不适合本试验使用。而Sathe等人使用的菌液PCR和菌落PCR能省去繁琐的提取质粒过程，减轻工作量，节省试验时间，且准确率不低，适用于大量重组DNA的筛选与鉴定，是一种经济、快速、准确的好方法。由于p MD18-T载体是线形载体，载体自连几率小，所以在实验过程中并未进行蓝白筛选，直接挑选数个单菌落进行菌液PCR，凝胶电泳结果表明基本都是阳性克隆，成功率很高。

在测序时，之所以选择送含有阳性克隆的菌液，是因为载体在细菌体内能够稳定复制，不易丢失。另外，送菌液测序一般只需将500μL菌液保存于洁净的离心管中，简单密封后即可邮寄。大肠杆菌可在室温下保持较高活力，在数天的常温运输过程中维持稳定。测序公司在收到菌液后，对其进行扩大培养，再抽提质粒进行测序，整个过程非常快，一般两三天就能将测序结果发回来，便于分析。若只送单纯的PCR产物或抽提得到的质粒，就需要将其置于塑料泡沫盒中并覆盖低温冰袋，尽量保持低温状态。如果在邮寄的路上出现意外拖延了时间，就可能会导致DNA的降解，影响测序结果。