实验七 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
一、实验目的
学习和掌握制备大肠杆菌感受态细胞的实验原理和方法。利用CaCl2法制备大肠杆菌的感受态细胞，用于重组质粒的转化。
二、实验原理
细菌感受态指的是容易接受外源DNA分子进入细胞的状态。决定感受态有多种因素，包括细菌生长分化的状态和环境因素。新鲜幼嫩的细菌由于其细菌外被还没有合成强有力的防卫层，最容易被侵入。所以采用接种后生长约两小时、OD590在0.4～0.6之间的菌液。一般状况下细菌细胞膜外表面都带有负电荷，而DNA分子由于其磷酸骨架上有很多磷酸根而带有负电荷，同性相斥力使DNA分子不易靠近。CaCl2分子中Ca2+带有两个正电荷，可以与细胞膜表面的负电荷结合，屏蔽斥力，使DNA分子容易接近。低渗溶液中细菌由于吸收液体而膨胀，也更容易被外源DNA分子侵入。所以常用低渗CaCl2溶液处理幼嫩的细菌来制备感受态细胞。也有人在CaCl2溶液中添加MgCl2来提高感受态敏感性。
三、实验仪器、材料和试剂
1.仪器:离心管(1.5mL、50mL)，枪头(1mL)，枪头盒，试管(灭菌)，三角瓶(灭菌)，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，冷冻离心机，超低温冰柜和制冰机。
2.材料:大肠杆菌DH5α。
3.试剂:LB培养基，无菌无离子蒸馏水，0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌后置于冰箱保存)，80％甘油(用0.1mol/LCaCl2溶液配，灭菌)。
四、实验步骤
1.在无菌操作超净工作台中将2mL液体LB培养基加到试管中，将接种环烧红，然后插入刚从超低温冰柜中取出的冻结的菌中，挑取单菌落DH5α到试管中的培养基中，37℃恒温摇床培养过夜。(以下操作除离心外都在无菌操作超净工作台上进行。)
2.在无菌超净工作台中取0.5mL上述菌液到50mL LB液体培养基中，37℃摇床培养2～3h，使OD590达到0.375(＜0.4～0.6，细胞数＜108/mL)。
3.将菌液转入在50mL灭菌离心管中，两个管平衡后冰上静置10min后，在4℃，5000rpm离心10min，无菌条件下倒净上清液于废液烧杯中，立即加入30mL 0.1mol/L冰冷的CaCl2溶液，在冰盒中研磨并使之溶解，冰上放置30min。
4.在4℃，以5000rpm离心10min，无菌条件下倒净上清液于废液烧杯中，立即加入1.3mL 0.1mol/L冰冷的CaCl2溶液，在冰盒中研磨并使之溶解后加入0.7mL80％甘油混匀，以100μL体积分装到1.5mL无菌离心管中，可以马上使用，也可以于－80℃冰箱长期保存(一年)。
从准备好的菌液开始到分装菌液约5～6h。
五、结果与分析
1.将未经转化的感受态细胞涂布在含有氨卞青霉素的LB培养基上，应该没有菌落长出。因为未经转化的感受态细胞不含有携带抗氨卞青霉素基因的质粒。如果有，可能是受到含有抗性基因质粒细菌的污染。
2.取已知浓度的pUC191 μL与分装好的大肠杆菌感受态细胞混匀，按照实验八的实验步骤进行转化后，涂布在含有氨卞青霉素的LB培养基上，统计长出的菌落数，其结果可以说明制备的感受态细胞的质量。
六、注意事项
溶解菌体沉淀时不要剧烈震荡、用枪头抽打，避免使菌体细胞破裂死亡。
七、思考题
1.为什么要用CaCl2处理细菌?浓度重要吗?
2.为什么用来制备感受态细菌的生长时期对制备效果至关重要?
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
