果树类植物的组织培养技术

任务三　果树类植物的组织培养技术

一、苹果的组织培养技术

苹果（Malus pumila Mill.，见图7-17）为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、苹果属落叶乔木，通常树木可高至15 m，但栽培树木一般只高3～5 m。苹果原产于土耳其东部，全世界温带地区均有种植。中国、美国、法国是主要的苹果生产国，而在单产上领先的则是法国、意大利、美国和土耳其。中国辽宁、河北、山西、山东、陕西、甘肃、四川、云南、西藏常见栽培。树干呈灰褐色，树皮有一定程度的脱落。果实一般呈红色，但需视品种而定。苹果果实富含矿物质和维生素，为人们最常食用的水果之一。

图7-17　苹果

（一）外植体选择

取苹果五年生树当年生枝的腋芽茎尖作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

一般于4月下旬，取五年生树腋芽已萌发并露出4～5片小叶的一年生枝条，用清水洗净后，按芽剪段，在超净工作台上用0.1%的HgCl2溶液消毒8～10 min，用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干表面水分，取其腋芽茎尖生长点1～2 mm为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为改良C17（大量元素与C17相同，其他成分同MS培养基）；芽的诱导培养基：①改良C17+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+水解酪蛋白（CH）300+3%蔗糖；芽增殖培养基：② 改良C17+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+3.5%蔗糖；生根培养基：③ 1/2改良C17+IBA 0.5 mg/L+IAA 1.0 mg/L +PP333 1.0 mg/L+2.5%蔗糖。

上述培养基均加琼脂0.7%，pH为5.8。培养温度为（25±3）°C，光照时间为14 h/d，光照度为2 000 lx。接种后先光照7 d，再暗培养7 d，以后一直光培养。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种于培养基①中，茎尖接种30 d左右，幼叶明显长大，培养40～45 d嫩梢开始生长，65 d左右时生长快的嫩梢可达2 cm，且多为单梢。经2～3次切分，在相同新鲜培养基①中增殖培养后，嫩梢多以芽丛分化生长。再将丛状芽切分转移至培养基②中扩大增殖，每隔30～40 d继代1次，增殖系数可达6～7。

（五）生根与炼苗移栽

切取继代芽苗上高1.5 cm以上的嫩梢，扦插于培养基③上诱导生根，并在接种后进行5～7 d的暗培养再光培养，可使芽苗生根率达87%以上。生根培养25 d后，将试管移至温室进行强光锻炼（光照度为1 800～3 500 lx）15～20 d，再打开瓶塞适应2 d后移栽。

移栽时小心将小苗取出，用15 mg/L的KMnO4溶液洗净根部培养基，移入装有蛭石、园土（1∶2）的营养钵内（蛭石用0.1%的多菌灵搅拌消毒），用塑料薄膜保温、保湿，并适时喷0.1%的多菌灵药液，以防止幼苗根茎发生病害。30 d后去膜，60 d后成苗率可达85%。

二、李子的组织培养技术

李子（Prunus salicina Lindl.，见图7-18）别名嘉庆子、布霖、玉皇李、山李子，为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、梅属落叶乔木。李子产于辽宁、吉林、陕西、甘肃、四川、云南、贵州、湖南、湖北、江苏、浙江、江西、福建、广东、广西和台湾等地，生于山坡灌丛中、山谷疏林中或水边、沟底、路旁等处，海拔400～2 600 m，中国各省及世界各地均有栽培，为重要温带果树之一。其果实7～8月间成熟，饱满圆润，玲珑剔透，形态美艳，口味甘甜，是人们最喜欢的水果之一。李子中含有多种营养成分，有养颜美容、润滑肌肤的作用，李子中抗氧化剂含量高得惊人，堪称是抗衰老、防疾病的“超级水果”。李子味酸，能促进胃酸和胃消化酶的分泌，并能促进胃肠蠕动，因而有改善食欲、促进消化的作用，尤其对胃酸缺乏、食后饱胀、大便秘结者有效。新鲜李子肉中的丝氨酸、甘氨酸、脯氨酸、谷酰胺等氨基酸，有利尿消肿的作用，对肝硬化有辅助治疗效果。

图7-18　李子

（一）外植体选择

取李子顶芽及腋芽作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

取1年生枝的顶芽或腋芽，先用70%的酒精浸泡30 s，然后用0.1%的HgCl2溶液消毒3～4 min，用无菌水冲洗4～5次，最后用0.1%的过氧乙酸浸泡1～3 min，用无菌水冲洗4～5次，剥取0.5 mm的顶芽及腋芽为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽诱导培养基为①MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1～0.3 mg/L；壮苗培养基为②MS+6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L+IAA 0.2 mg/L；生根培养基为③MS+IBA 2.0 mg/L+KT 0.4 mg/L+NAA 1.0 mg/L。

上述培养基均加琼脂0.7%，pH为5.8；①、②号培养基加蔗糖2%；③号培养基加蔗糖1.5%。培养温度为（25±2）°C，光照时间为16 h/d，光照度为1 500 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的0.5 mm顶芽及腋芽外植体接种于培养基①中，30～40 d后逐渐分化出丛芽，转入相同培养基①中，45～55 d后又分化形成新的丛生芽，经3～4次继代培养后转入壮苗培养基②中进行壮苗培养；15～20 d后，芽伸长并增粗，叶片浓绿，这时转入生根培养基③中，15 d左右可发根，此时及时移出驯化移栽。

三、杏的组织培养技术

杏（Armeniaca vulgaris Lam.，见图7-19）为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、杏属落叶乔木。杏树原产于中国新疆，是中国最古老的栽培果树之一。杏树在中国各地多有分布，尤以华北、西北和华东地区种植较多，少数地区为野生，在新疆伊犁一带野生成纯林或与新疆野苹果林混生，海拔可达3 000 m，世界各地也均有栽培。杏植株无毛；叶互生，阔卵形或圆卵形叶子，边缘有钝锯齿；近叶柄顶端有二腺体；淡红色花单生或2～3个同生，白色或微红色；圆、长圆或扁圆形核果，果皮多为白色、黄色或黄红色，向阳部常具红晕和斑点；暗黄色果肉，味甜多汁；种仁多苦味或甜味，花期3～4月，果期6～7月。杏果有良好的医疗效用，在中草药中居重要地位，主治风寒肺病，生津止渴，润肺化痰，清热解毒。杏仁还有美容功效，能促进皮肤微循环，使皮肤红润光泽。

图7-19　杏

（一）外植体选择

取杏树龄为3年、当年生枝条在室内催芽新梢的茎尖和带芽茎段作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

取催芽的新梢，用流水冲洗12 h，先用0.1%的新洁尔灭灭菌20 min，再用1%的过氧乙酸消毒6 min，用无菌水冲洗5次后，用无菌滤纸吸干，切取0.3 cm的茎尖和带芽茎段为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为改良MS或MS；芽诱导培养基：①改良MS（1/2NH4NO3）+10 g/L PVP（聚乙烯吡咯烷酮）+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+GA3 1.0 mg/L+山梨醇3%或蔗糖3%；生根培养基：②1/2MS+IBA 0.2 mg/L+蔗糖1.5%。

上述培养基均加琼脂0.5%，pH为5.8。培养温度为（25±1） °C，光照时间为15 h/d，光照度为3 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的茎尖和带芽茎段接种于培养基①中，培养35 d后，大于0.5 cm的新梢率为37.5%，增殖倍数为4～5。可将新梢切成茎尖和带芽茎段接种到相同的新鲜培养基①中进行继代增殖，每隔35 d可继代1次，一般可继代8次左右，随着继代次数的增加，增殖倍数和大于0.5 cm的新梢数量也逐渐提高。

（五）生根与炼苗移栽

将继代8次大于0.5 cm的新梢接种于生根培养基②中，有利于发根和促进根生长，生根效果最好，生根率最高。先暗培养4 d，然后转入光下培养，生根率为70%～80%，每株平均根数为2.5～3.1条。2 d后取出试管苗，洗净根部培养基，移栽于沙、蛭石、园土为1∶1∶1的混合基质中，勤浇水，盖膜保湿7 d左右，温度为28 °C，保持昼夜温差为6～8 °C，有利于促进成活。

四、桃的组织培养技术

桃（Amygdalus persica L.，见图7-20）为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、桃属落叶小乔木。原产中国，各省区广泛栽培，世界各地均有栽植。树皮暗灰色，随年龄增长出现裂缝；叶为窄椭圆形至披针形，先端成长而细的尖端，边缘有细齿，暗绿色有光泽，叶基具有蜜腺；花单生，从淡至深粉红或红色，有时为白色，有短柄，早春开花；近球形核果，表面有毛茸，肉质可食，为橙黄色泛红色，有带深麻点和沟纹的核，内含白色种子。桃花可以观赏，果实多汁，可以生食或制桃脯、罐头等，核仁也可以食用。

桃树树干上分泌的胶质，俗称桃胶，可用作黏结剂等，可食用，也供药用，有破血、和血、益气之效。桃子素有“寿桃”和“仙桃”的美称，因其肉质鲜美，又被称为“天下第一果”，适宜低血钾和缺铁性贫血患者食用。

图7-20　桃

（一）外植体选择

选带腋芽的茎段作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

将3年生树冠外缘向阳果枝的嫩梢腋芽取下，在无菌条件下，用75% 酒精5 mL和0.2%的HgCl295 mL混合液灭菌7～10 min，用无菌水冲洗4～6次，然后切成1 cm带腋芽的茎段为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽诱导与增殖培养基：① MS+6-BA 0.8～2.0 mg/L+IBA 0.4～0.8 mg/L+GA3 3.0～5.0 mg/L；生根培养基：② MS+IBA 0.4～0.7 mg/L+NAA 0.1～0.3 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.8%，pH为5.8。培养温度为（25±1）°C，光照时间为12 h/d，光照度为1 500 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种于芽诱导与增殖培养基①中，培养5～7 d后外植体腋芽开始萌动，培养10～15 d后腋芽抽出展叶，培养23～25 d进行继代培养。在相同新鲜培养基①中继代时间不能超过25 d，否则，芽增殖能力逐渐减弱，同时叶片变黄、变脆、易脱落，甚至枯心死亡。每隔23～25 d继代1次，芽增殖高达7.5倍。如此反复继代，可在短时间内获得大量苗。

（五）生根与炼苗移栽

当无根苗长到1 cm以上时即可切下，接种于培养基②中，培养15 d左右有许多粗壮的根长出，培养18 d，每株苗平均生根4.2条。当苗高3 cm以上时，将试管苗培养瓶移到室外打开瓶塞，炼苗3 d后，小心将小苗从培养瓶中取出洗净根部培养基，再沾上用1 mg/L的IBA调制成的黄泥浆，然后定植于铺有2～3 cm厚细沙、蛭石、腐殖土（1∶1∶2）的混合基质插床中，盖上塑料薄膜和遮阳网以保湿。4 d后逐渐增大揭膜程度，10 d后除去薄膜和遮阳网，并浇1次MS稀释营养液，移栽成活率达80%以上。

五、梨的组织培养技术

梨（Pyrus spp.，见图7-21）为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、梨属多年生落叶乔木。中国梨栽培面积和产量仅次于苹果，其中安徽、河北、山东、辽宁四省是中国梨的集中产区，栽培面积约占一半左右，产量超过60%。中国栽培的梨树品种，主要分为秋子梨、白梨、砂梨、洋梨4个物种。叶子卵形，花多白色，一般梨的颜色为外皮呈现出金黄色或暖黄色，里面果肉则为通亮白色，鲜嫩多汁，口味甘甜，核味微酸，是很好的水果。梨除可供生食外，还可酿酒，制梨膏、梨脯，也可药用，如梨果治热咳，切片贴之治火伤；梨汁可润肺凉心，解疮毒、酒毒；梨花能去面黑粉刺；梨叶煎服，可治风寒和小儿寒疝；梨树皮能除结气咳逆等症。

（一）外植体选择

取梨一年生带芽幼枝、顶端作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

取一年生梨幼嫩枝条顶端，先用肥皂水、自来水清洗干净，然后用70%的酒精灭菌3～4 min，再用0.1%的HgCl2溶液消毒8～10 min，用无菌水冲洗4～5次，取其顶端0.8～1.0 cm为外植体以供接种用。

图7-21　梨

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽分化培养基为①MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+GA3 5.0 mg/L；芽增殖培养基为②MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L+GA3 2.0 mg/L；生根培养基为③1/2MS。

上述培养基均加蔗糖3%，①中加琼脂0.9%～1.0%，pH为5.8。培养温度为（25±2）°C，光照时间为16 h/d，光照度为2 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种于培养基①中，培养7 d左右，顶芽萌动，生长点也开始伸长，培养30 d左右，芽的分化生长很快、苗势良好，培养35～40 d，嫩茎生长和增殖，可转接到增殖培养基②中进行增殖培养，每隔30 d左右继代增殖1次。

（五）生根与炼苗移栽

待无根苗生长到2～3 cm时，先用IBA 100 mg/L溶液浸泡25 h，再转移到不含激素的生根培养基③中，20 d左右开始生根，30 d左右根可长到1.5 cm左右即可移栽。移栽时，先移入温室闭瓶炼苗7 d，然后小心取出小苗洗净根部培养基，移栽于盛有园土的花盆中，盖薄膜保持一定湿度，于15～20 °C下培养，30 d后去掉薄膜，每隔7 d喷洒MS稀释营养液1次，培养60 d后即可移栽，成活率达90%以上。

六、核桃的组织培养技术

核桃（Juglans regia，见图7-22）又名胡桃、羌桃，为被子植物门、双子叶植物纲、胡桃目、胡桃科、胡桃属落叶乔木。核桃原产伊朗，分布于中亚、西亚、南亚和欧洲，生于海拔400～1 800 m的山坡及丘陵地带。核桃在中国的水平分布范围：从北纬21°08′的云南勐腊县到北纬44°54′的新疆博乐县，纵越纬度23°46′；西起东经75°15′的新疆塔什库尔干，东至东经124°21′的辽宁丹东，横跨经度49°06′。核桃主产区在云南、陕西、山西、四川、河北、甘肃、新疆、安徽等省（区），其中安徽省亳州市三官林区被誉为亚洲最大的核桃林场。核桃树一般高达3～5 m，树皮灰白色，浅纵裂，枝条髓部片状，幼枝先端具细柔毛（2 年生枝常无毛）；也有高达20～25 m，树干较别的种类矮，树冠广阔，树皮幼时灰绿色，老时则灰白色而纵向浅裂，小枝无毛，具有光泽，被盾状着生的腺体，灰绿色，后来带褐色。核桃与扁桃、腰果、榛子并称为世界著名的“四大干果”。核桃仁含有丰富的营养素，对人体有益，可强健大脑，是深受老百姓喜爱的坚果类食品之一，被誉为“万岁子”“长寿果”。

图7-22　核桃

（一）外植体选择

取核桃母树当年生新梢茎段作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

剪取核桃当年生新梢，用肥皂水冲洗干净，无菌水冲洗2 次，切成2 cm左右的带芽茎段。用70%的酒精消毒30 s，然后用400 mg/L的青霉素+400 mg/L的链霉素灭菌30 min，立即加入0.1%的HgC12溶液中消毒10～15 min，用无菌水冲洗4～6次，以此作为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽诱导培养基：①1/2MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+Vc 2～5 mg/L；芽增殖培养基：②MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L；壮苗培养基：③ MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L；生根培养基：④ 1/2MS+IBA 2.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.6%～0.8%，pH为5.8。培养温度为（25±2）°C，光照时间为12 h/d，光照度为1 500～2 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种到芽的诱导培养基①上，培养7～10 d腋芽开始萌动，再生梢长至1～2 cm时，切下再生梢接种到培养基②上，培养30～40 d后，再生梢可长出4～7节且基部长出丛生芽。将丛生芽切成单芽或再生梢切成1.5 cm左右的带芽茎段，接种于壮苗培养基③中，促使小苗稳健生长，小苗逐渐长高变得粗壮。

（五）生根与炼苗移栽

将苗高约4 cm、生长健壮的无根苗切成单苗，接种于生根培养基④中，培养8～10 d开始生根后，转入蛭石基质中，30 d左右，根系发育完好即可移栽。

移栽时，小心将生根苗从培养瓶中取出，洗净附着在根上的培养基，移入装有沙土、蛭石、腐殖土（2∶2∶1）混合基质的容器中，用塑料薄膜保温、保湿，7 d后揭膜，每隔7 d左右浇1次MS稀释营养液，7～10 d根系即可恢复生长，30 d左右，成活率可达70%，然后转入土壤中定植，以后按常规田间管理，植株生长良好。

七、山莓的组织培养技术

山莓（Rubus corchorifolius，见图7-23）又名树莓、山抛子、牛奶泡、撒秧泡、三月泡、四月泡、龙船泡、大麦泡、泡儿刺、刺葫芦、馒头菠、高脚波等，为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、悬钩子属多年生直立灌木。中国除东北三省、安徽、四川、贵州、甘肃、青海、新疆、西藏外，其余各省均有分布，其中湖北西北部山区大量存在。朝鲜、日本、缅甸、越南也有分布，多生于向阳山坡、山谷、荒地、溪边和疏密灌丛中潮湿处。山莓树高1～3 m；枝具皮刺，幼时为柔毛；单叶，卵形至卵状披针形。山莓可供鲜食或加工蜜饯等。山莓的果味甜美，含糖、苹果酸、柠檬酸及维生素C等，可供生食，制果酱及酿酒。山莓的根和叶可入药，具有涩精益肾助阳明目、醒酒止渴、化痰解毒之功效。

图7-23　山莓

（一）外植体选择

取其茎尖和带芽茎段作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

取山莓小灌木新生枝条，用自来水冲洗干净，先用70%的酒精灭菌0.5 min，再用0.1%的HgC12消毒8～10 min，用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干水分后，剪截成1 cm的带芽茎段和茎尖为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；愈伤组织诱导培养基：①MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L；芽诱导培养基：②MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；芽增殖培养基：③MS+6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.1 mg/L；生根培养基：④MS+NAA 0.5～1.0 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH为5.8。培养温度为23～26 °C，光照时间为18 h/d，光照度为2 500～3 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种到培养基①上，培养20 d后，基部长出浅黄色愈伤组织；再培养20 d左右，形成直径0.5～1.5 cm大小不等、质地较为紧密的愈伤组织。然后将愈伤组织分切转接到培养基②上，培养20 d后，芽伸长至4 cm，基部萌发丛生芽3～7个。将丛生芽剪截成带1～2个芽的茎段或芽块接种至培养基③上，30 d后可长成具有6～8片叶片，高约4 cm的健壮无根苗，同时，基部分化出4 个左右的小苗，可如此反复转接，不断增殖，获得大量无根苗。

（五）生根与炼苗移栽

将无根丛芽苗切成单株，转接到生根培养基④上，在25～27 °C条件下培养约5 d，就可在幼茎基部形成根原基，而在20 °C条件下则需8～10 d形成根原基。根原基形成后就可出瓶移栽。

移栽前先打开培养瓶盖炼苗1～2 d。移栽时，小心取出培养瓶中试管苗，洗净根部培养基，可直接移栽到稻壳灰与黄沙土（11∶）拌匀的基质中。浇透水，盖上薄膜，使薄膜内的相对湿度保持在90%左右，成活率可达85%以上。30 d左右，可移栽至大田。

八、香蕉的组织培养技术

香蕉（Musa nana，见图7-24）为被子植物门、单子叶植物纲、芭蕉目、芭蕉科、芭蕉属，植株为大型草本植物。香蕉原产亚洲东南部，主要分布在东、西、南半球南北纬度30°以内的热带、亚热带地区，世界上栽培香蕉的国家有130个，以中美洲产量最高，其次是亚洲，中国是世界上栽培香蕉的古老国家之一，有2 000多年的栽培历史，主产区为广东、广西、海南、福建、云南和台湾。从根状茎发出，由叶鞘下部形成高330～660 cm的假秆；叶长圆形至椭圆形，10～20枚簇生茎顶。穗状花序大，由假秆顶端抽出，花多数，淡黄色；果序弯垂，结果10～20串，有50～150个。植株结果后枯死，由根状茎长出的吸根继续繁殖，每一根株可活多年。香蕉是世界四大类水果之一，也是我国华南四大名果之一，富含碳水化合物，大蕉更多，是非洲、中美洲地区的主要粮食；香蕉也具有通便、降血压、治糖尿病等医疗保健作用；也可加工成糖水罐头、香蕉片、香蕉酱、提取香精、酿酒；球茎、吸芽、花蕾可作饲料，花蕾还可食用，茎叶可制绳。

图7-24　香蕉

（一）外植体选择

取香蕉吸芽（吸芽是由香蕉基部球茎上长出的一种侧芽，俗称吸芽。按其生长于母株的位置和抽出先后顺序分为头路牙、二路芽、三路芽和四路芽等。还有一种俗称“隔山飞”的吸芽。隔山飞是在母株采收果穗后，距其残茎一定距离处长出的吸芽。此类吸芽增殖力最强，接种后抽芽快，分化能力强，是用于组织培养的最佳材料，选用“隔山飞”的吸芽为外植体材料最好）作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

从田间取吸芽，先用自来水冲洗干净，再用1%的洗衣粉洗2次。切去吸芽，先剥去外层苞叶的部分基部组织，保留具有顶芽和侧芽原基的小干茎（5～10 cm），经紫外线灯灭菌30～40 min后，用0.1%的HgC12消毒15～20 min，其间常翻动，以便充分灭菌，用无菌水冲洗5～6次，将吸芽切成若干小块，每块约1 cm×2 cm，每块应具有1～2个芽原基为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；吸芽培养基①MS+6-BA 5.0 mg/L+KT 0.5 mg/L+2%蔗糖；茎尖培养基②改良MS培养基（MS无机盐+盐酸硫胺素0.5 mg/L）+6-BA 2.0～5.0 mg/L+3%蔗糖；茎尖培养基③改良MS+6-BA 2.0 mg/L+蔗糖3%（液体培养基）；生根培养基④MS+KT 0.5 mg/L+NAA 0.8 mg/L+蔗糖3%+活性炭0.3%。

上述培养基中①、②、④号培养基均加琼脂0.7%，pH为5.8。培养温度为25～28 °C，光照时间为10～12 h/d，光照度为2 000～3 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的外植体接种到培养基①上，先暗培养，待芽萌动后，每天光照10 h，光照度为2 000～3 000 lx，经40～60 d培养，可形成丛生芽，每个丛芽有2.5～3个小芽。从培养的丛生芽中选取一些高5 cm，生长较粗壮的、基部膨大的无根苗，用镊子将小叶片剥除，直到生长点充分暴露，然后切取大小0.5～1.5 mm、带有1～2个叶原基的茎尖，经无菌水洗净后接种于液体培养基③中进行振荡培养。待茎尖长至3～5 mm大小时便可转移至培养基②中进行固体培养。开始生长缓慢，基部逐渐长大形成基盘，并分化出白色球状小突起，经培养60 d左右，逐渐形成丛生芽，芽数通常有2～3个。此时将丛生芽切成单芽再转至相同新鲜培养基②上培养。当苗高2 cm时，具有丛芽的基盘切成若干块，每块带1苗，按上述方法再继代繁殖至一定数的小苗后即可生根培养。

（五）生根与炼苗移栽

将继代增殖苗从基盘处切离成单苗后，接种于生根培养基④上，15 d后逐渐形成生根苗。待小植株长到7～8 cm，具5片绿叶时便可移栽。移栽前，先将培养瓶置阳光下闭瓶炼苗2～3 d，再打开瓶盖晒苗适应3 d，取出小苗移栽于能保湿、保温、防虫的大棚内，每隔2 d喷雾1次，定期喷施杀虫农药。移苗10 d后可喷施0.5%的KNO3肥液2次，每隔7 d喷1次。20 d后移栽成活率可达75%。

九、枇杷的组织培养技术

枇杷（Eriobotrya japonica，见图7-25）别名芦橘、金丸、芦枝，为被子植物门、双子叶植物纲、蔷薇目、蔷薇科、枇杷属常绿小乔木。枇杷原产亚热带，要求较高的温度，中国的四川、云南、贵州、广西、广东、福建、台湾等省均有栽培。树高3～5 m，叶子大而长，厚而有茸毛，呈长椭圆形，状如琵琶，因此而得名。枇杷与大部分果树不同，在秋天或初冬开花，果子在春天至初夏成熟，比其他水果都早，因此被称是“果木中独备四时之气者”。枇杷的花为白色或淡黄色，有五块花瓣，以五至十朵成一束，可以作为蜜源作物。成熟的枇杷果实味道甜美，营养颇丰，并具有润肺、止咳、止渴的功效；也可把枇杷肉制成糖水罐头，或以枇杷酿酒。

图7-25　枇杷

（一）外植体选择

取枇杷顶芽作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

在2～3月份顶芽萌动季节，采取长1.5 cm左右的顶芽，用刀片刮去表皮毛及外层芽鳞后，再用流水冲洗2 h，切成长约1 cm，先用75%的酒精灭菌1.5 min，再用0.1%的HgC12消毒8～10 min，用无菌水冲洗5次，剥取0.3～0.5 cm的茎尖为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽诱导培养基：①MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L；芽增殖培养基：②MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根培养基：③1/2MS+NAA 0.5 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.8%，pH为5.8。培养温度为（25±1）°C，光照时间为12 h/d，光照度为1 500～2 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的0.3～0.5 cm茎尖外植体接种到培养基①上暗培养，在1～2 d内，若发现有部分外植体发生褐变，并使芽体周围的培养基染成浅褐色，必须及时把这部分芽转到新鲜培养基①上，否则，将会引起外植体死亡。在3～5 d发现有部分外植体基部产生成团的浅褐色疏松愈伤组织也必须在7 d内剥去。培养15～20 d芽开始萌动，在长出3片小叶片时，转为光培养，再培养15～20 d后有5～9片0.5～1.0 cm的小叶生出。这时可将芽转入增殖培养基②中，经25 d光培养，腋芽开始生长并形成芽丛，每株平均产生3个芽丛，最多可产生6个芽丛。再培养20 d左右，芽丛长到1.5 cm时，可切下转入相同新鲜增殖培养基②上进行扩繁。在扩繁过程中，芽体基部生长过大的愈伤组织必须及时除去。

（五）生根与炼苗移栽

当增殖芽丛长到1.5～2.0 cm高时切成单芽接种于培养基③上，10 d开始生根，20 d后每株生根7条以上，生根率达100%。移栽前，将生根苗瓶打开炼苗1～3 d。然后，小心取出小苗，洗净根部培养基，栽入稻糠灰与沙土（11∶）的基质中，保持湿度80%以上，成活率达90%以上。

十、葡萄的组织培养技术

葡萄（Vitis vinifera L.，见图7-26）别名草龙珠、赐紫樱桃、菩提子、蒲陶、山葫芦，为被子植物门、双子叶植物纲、鼠李目、葡萄科、葡萄属落叶藤本植物。原产亚洲西部，现世界各地均栽培，世界上约95%的葡萄集中分布在北半球，中国各地均有栽培，主产区有新疆的吐鲁番、和田，山东的烟台，河北的张家口、宣化、昌黎，辽宁的大连、熊岳、沈阳及河南的芦庙乡、民权、仪封等地。小枝为圆柱形，有纵棱纹，无毛或被稀疏柔毛，叶卵圆形，圆锥花序密集或疏散，多花，与叶对生，基部分枝发达，果实为球形或椭圆形，种子为倒卵椭圆形，花期4～5月，果期8～9月。其营养价值很高，可制成葡萄汁、葡萄干和葡萄酒。粒大、皮厚、汁少、水多，皮肉易分离，味道酸甜可口。耐贮运的欧亚种葡萄又称为提子。人类在很早以前就开始栽培这种果树，是世界上最古老、分布最广的一种水果之一，几乎占全世界水果产量的1/4。葡萄不仅味美可口，而且营养价值很高，常食葡萄对神经衰弱、疲劳过度大有裨益，同时具有补气血、益肝肾、生津液、强筋骨、止咳除烦、补益气血、通利小便的功效；葡萄酒是以葡萄为原料的最重要加工品；另外，新开发的葡萄籽油，在国外被用作婴儿和老年人的高级营养油及高空作业者和飞行人员的高级保健油，颇受世人关注。

图7-26　葡萄

（一）外植体选择

取葡萄枝条顶稍作为外植体。

（二）无菌外植体的获得

取枝条顶稍1.0～2.0 cm的梢尖，去掉幼叶，先用流水冲洗30 min，再用75%的酒精灭菌5 s，然后用无菌水洗3次，用0.1%的HgC12消毒5 min左右，最后用无菌水冲洗5次。把芽放在解剖镜下，用镊子、刀片、解剖针等工具把芽外面的幼叶和叶原基逐层除去，使生长点暴露。用刀切下含有1～2个叶原基，大小为0.2～0.3 mm的生长点为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；茎尖分化培养基：① 1/2MS+6-BA 0.1～0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+ GA3 0.2 mg/L；继代增殖培养基：② MS+6-BA 0.1～0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L；生根培养基：③ 1/2MS+IAA 0.4 mg/L+IBA 0.1 mg/L。

上述培养基均加蔗糖2%，琼脂0.8%，pH为5.8。培养温度为（25±2）°C，光照时间为16 h/d，光照度为1 000～1 500 lx。

（四）生长与分化

将灭过菌的0.2～0.3 mm的茎尖外植体接种到培养基①上进行培养。30 d左右，茎尖开始分化出芽和侧芽，60 d左右形成芽丛，即可进行大量增殖。将增殖后的小芽丛转入到增殖培养基②上，每隔30 d继代1次，每个芽丛增殖倍数约为10。

（五）生根与炼苗移栽

当增殖芽丛长成2.0～3.0 cm的无根幼苗后，切成单苗接种于培养基③上，7～15 d开始生根，30 d左右即可形成发达的根系，生根率达90%，同时可长出5～7片新叶。待试管苗长出完整的根系和新叶后，把瓶子移入温室中，即可打开培养瓶，历时7 d左右。把苗从试管中取出，洗净根部培养基，栽入经过干热灭菌处理的蛭石内，盘上用塑料薄膜罩严，置于散射日光下，温度在20 °C左右，保持自然湿度，炼苗15 d。从第5 d开始把塑料薄膜边缘揭开3～5 cm宽的一条通风隙。以后每隔2 d，把通风隙加宽一倍，到第15 d完全揭开塑料薄膜，炼苗完成，此时幼苗开始长出新叶及新根，便可移入土中栽培，成活率达95%以上。