组织培养育苗技术

6．1．1　组织培养育苗的特点及应用

组织培养是把植物的部分器官、组织、细胞以及原生质体等，在无菌和人工控制的条件下，接种到培养基上，使之形成完整植株的繁殖方法。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。

1）植物组织培养的特点

（1）优点

①繁殖系数大：半年内可由一株苗木繁殖100万株新个体。

②解决常规育苗困难的问题。

③能培育脱毒苗：培养茎尖分生组织（0．2～0．3mm），可以脱掉病毒，育出无病毒苗（又称脱毒苗）。脱毒苗抗逆性强，质优，生长旺盛。

④不受季节限制：一年四季均可进行，可实现工厂化育苗。

⑤利于种质资源的保存。

（2）缺点

①需要一定的设备条件，技术要求较高，操作人员需要专门的培训。

②试验阶段成本较高。

2）植物组织培养的分类

（1）依据用作外植体的植物材料划分

①植株培养：是以具备完整植株形态的材料（如幼苗、较大植株）为外植体的无菌培养。常用于提供适合接种的外植体，或用于研究植株在某些培养基上的反应等。

②器官培养：即以很少的植物器官（如根尖和根切段，茎尖、茎节和茎切段，叶原基、叶片、叶柄、叶鞘、子叶，花瓣、花药、花丝，果实、种子等）为材料进行无菌培养，形成新植株。

③胚胎培养：即指通过对幼胚、子房等的培养，使之发育不完全的胚胎部分，形成完整植株的过程。它又可分为胚乳培养、原胚培养、胚珠培养、种胚培养等。胚胎培养在某种程度上可克服远缘杂交胚的败育障碍。采用胚乳进行培养，为三倍体植物育种开辟了新的途径。

④组织培养：是以分离出的植物各部位的组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓等）或诱导出的愈伤组织为外植体的无菌培养。这是狭义的组织培养。

⑤细胞培养：指对单个离体细胞或较小细胞团的培养。

⑥原生质体培养：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体的离体培养，通常分为非融合培养、融合培养等类型。此类培养可进行植物体细胞杂交，形成新个体，为品种改良开辟新途径。

（2）依据所用的培养基不同来划分

①固体培养：即使用固体培养基进行组织培养。

②液体培养：即使用液体培养基进行组织培养。它又可细分为静止培养、旋转培养、振荡培养等。

3）植物组织培养的应用

（1）无性系的快繁　对于不能用普通繁殖法或用普通繁殖法繁殖太慢的植物，如兰科植物、蕨类植物和许多观叶植物，组织培养技术是实现商品化生产的最佳途径。同时，对于新育成品种、新引进品种、稀缺品种、濒危植物和优良单株等可扩大繁殖。一个新育成品种问世后，可在两三年内迅速推广。

（2）脱毒苗培育　即利用植物茎尖上病毒分布少甚至没有病毒的特点，进行培养、增殖。使用无病毒种苗，可以减少直至杜绝病毒病的传播。

6．1．2　植物组织培养的基本设备

1）植物组织培养实验室

在进行组织培养之前，首先要建立实验室。实验室主要包括准备室、接种室、培养室。

（1）准备室　用以进行组培时所需器具的洗涤、干燥、保存；蒸馏水的制备；培养基的配制、分装、包扎和高压消毒；处理大型植物材料，以及进行生理、生化的分析等各种操作。其要求与一般化学实验室相同，需要的设备和用具有：天平、酸度计、冰箱、烘箱、实验台、药品柜、洗涤用水槽、各种试剂瓶和容量瓶等。

（2）接种室（无菌室）　要求室内干爽、安静、清洁、明亮，保持良好的无菌或低密度有菌状态。主要用于培养材料的表面消毒、外植体的接种、无菌材料的继代转接等。室内设超净工作台、紫外灯、双目实体解剖镜、接种工具等。

（3）培养室　要求室内洁净、干燥，是进行初代、继代、生根培养的场所。主要设备和用具有：空调、培养架、定时器、日光灯、光照培养箱等。

2）仪器设备

（1）制备培养基设备　分析天平、托盘天平、冰箱、培养基分装器、蒸馏水器、酸度计等。

（2）灭菌设备　高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、细菌过滤器等。

（3）接种设备　超净工作台、接种箱、灭菌器、解剖镜等。

（4）培养设备　光照培养架、培养箱、空气调节器、摇床、除湿机等。

（5）器皿和用具　试管、三角瓶、培养皿、试剂瓶、搪瓷锅、量筒、镊子、剪刀、解剖刀、酒精灯等。

6．1．3　培养基及其制备

1）培养基的基本组成

组织培养的培养基种类较多，包括无机营养、有机成分、碳素、琼脂、生长调节剂、糖、水等。

（1）无机营养

①大量元素：一般指浓度大于0．5mmol/L的营养元素，包括C，H，O，N，P，K，Ca，Mg，S等。它们是植物细胞中合成核酸、蛋白质、酶系、叶绿素等必不可少的营养元素。

②微量元素：包括Fe，Cu，Mo，Na，Zn，Mn，B，Co等。它们在植物的生命活动中，多以辅基形式在酶系中起着重要的作用。在培养基中添加10－7～10－5mmol/L即可满足需要。

（2）有机成分

①维生素：主要有维生素B1（盐酸硫胺素）、维生素B3（烟酸）、维生素B6（盐酸吡哆素）、生物素、叶酸等。它们以辅酶的形式参与酶系的活动及细胞蛋白质、脂肪、糖代谢等重要的生理活动。

②氨基酸：主要有甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等。它们能促进不定芽、胚状体的分化。

③肌醇：利于活性物质发挥作用，并参与糖代谢，能促进培养物快速生长。

（3）糖　最好的是蔗糖，其次是葡萄糖和果糖。糖是不可缺少的碳源和能源，还可维持一定的渗透压。愈伤组织与不定芽诱导最适的蔗糖浓度为3%。

（4）琼脂　从海藻中提取，主要组分为无取代的琼脂糖。其本身没有任何营养成分，遇热液化，在常温下固化。其无毒、无味，化学性质稳定，且可使培养基中各种可溶性物质均匀地扩散分布。一般用量为7%，培养基偏酸时其用量酌情增加。加热时间过长，环境温度过高，均会影响固化。

（5）植物生长调节剂　常用的主要有三大类：细胞分裂素类、生长素类、赤霉素类，对不定芽、胚状体、不定根等起重要作用。

①细胞分裂素类：包括激动素（KT）、玉米素（ZT）、6唱苄基氨基嘌呤（6唱BA）等。其作用强弱依次是ZT＞BA＞KT。它们具有促进细胞分裂、延缓组织衰老、诱导不定芽分化等作用。

②生长素类：包括萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、2，4唱D等。其作用强弱依次是2，4唱D＞NAA＞IBA＞IAA。它们能促进不定根分化，低浓度2，4唱D有利于胚状体的分化。

③赤霉素类：通常使用赤霉酸GA3，它能促进已分化芽的伸长，但不利于不定芽、不定根的分化。

（6）水　科研工作中宜选用蒸馏水或饮用纯净水。工厂化大量生产时，可就近选择水质软、清洁、无毒害的水源。

（7）其他

①天然生长促进物质：主要有麦芽提取液、酵母提取液、黄瓜汁、番茄汁、椰子汁、柑橘汁等，用于离体胚珠和胚培养。

②活性炭：吸附非极性物质和色素等大分子。通常使用浓度为0．5～10g/L，对防止褐变有较为明显的效果。

③防止褐变的添加剂：常用的防止褐变的氧化试剂有抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸及其盐酸盐等。

2）MS培养基

MS培养基（Murashige和Skoog，1962）的主要成分如表6．1所示。

表6．1　MS培养基①的主要成分表

①一般培养基pH＝5．6～5．8，有时达6．0；对于少数喜酸性植物，pH＝4．6～5．4。
②铁盐：7．45gEDTA唱Na2（乙二胺四乙酸钠）和5．57gFeSO4·7H2O溶于1L水中，每升培养基取此液5mL。

3）其他常用培养基

尼许培养基（Nitsch，1951）、米勒培养基（Miller，1963）、改良怀特培养基（White，1963）、LS培养基（Linsmaier和Skoog，1965）、H培养基（Bourgin和Nitsch，1967）、T培养基（Bourgin和Nitsch，1967）、B5培养基（Gamborg等，1968）、N6培养基（朱至清等，1974）、KM唱80培养基（1974）等，也是常用的培养基。

4）培养基制备技术

（1）准备工作　玻璃器皿的洗涤是组培中很重要的准备工作。洗涤的质量对组培的结果有很大影响。清洗程序一般为：清水冲洗→洗洁精水刷洗→清水冲洗→用蒸馏水冲1～2次→晾干或烘干备用。洗涤后的玻璃器皿空置时间不要过长，最好不超过两周。

（2）母液配制　在组织培养的过程中，配制培养基是日常必做的工作。通常先将各种药品配制成浓缩一定倍数的母液，又称为浓缩贮备液。以MS培养基为例，配制各种母液和1L培养基所需各种母液的吸取量，如表6．2所示。

表6．2　MS培养基母液的配制

①大量元素母液的配制：大量元素母液可配成浓度10倍母液。用感量0．01g的天平按表6．2称取药品，分别加蒸馏水溶解后，再用磁力搅拌器搅拌，促进溶解。注意Ca2＋和