植物组织冰冻切片技术

实验三十七　植物组织冰冻切片技术

【实验目的】

1.学习冰冻切片机的操作技术。

2.掌握冰冻切片的快速包埋法。

3.掌握冰冻切片的基本流程并能独立进行切片观察。

【实验原理】

冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。与常规的石蜡切片相比，冰冻切片因其不经过脱水和透明等步骤，可以缩短常规石蜡切片缓慢而复杂的处理过程，减少对样品组织结构的损伤，更好地保存生物分子的活性。同时，它具有快速、简便、易操作等特点，有利于进行细胞生物学(如免疫定位)和分子生物学(如原位杂交)的研究。

【实验材料】

雌蕊、雄蕊，叶芽等植物材料。

【实验器材】

冰冻切片机、包埋盒、镊子、载玻片等。

【药品试剂】

4%多聚甲醛、1%戊二醛、PBS缓冲液、蔗糖、液氮、包埋剂等。

【实验内容与步骤】

1.准备工作

固定液: 4%多聚甲醛、1%戊二醛和4%蔗糖(蔗糖浓度应根据材料含水程度而定)。

其他:冰(全程冰浴)、1.5ml离心管或玻璃小瓶(装有固定液，用于取材)。

2.取材和固定

在温室下取新鲜材料，切成合适大小和形状，立即投入冰浴的固定液中。

3.洗涤

用含有相同浓度蔗糖的PBS缓冲液清洗，每次15分钟，重复清洗4次。

4.包埋

包埋盒中先滴加适量包埋液，再将固定好的样品轻轻移至包埋盒中，根据需要摆好位置。最后用镊子固定包埋盒，并缓缓浸入液氮，使包埋块快速冰冻。冰冻好的包埋块可以直接进行冰冻切片或在－80℃保存。

5.切片

①开启冰冻切片机，检查各项工作指标是否正常。

②根据需要调整腔体温度和样品头温度;对于植物材料切片而言，常用的腔体温度为－18℃;常用的样品头温度为－20℃。

③待温度达到所需值，打开腔体照明灯，安放刀片。

④在样品托上固定包埋块，用单面刀片修整包埋块。

⑤适当调整刀架的切片角度，根据标本调整刀架或刀片的位置。

⑥移开刀刃护罩，松开手轮固定插销。

⑦按粗动键使标本移向刀片，转动手轮进行修片，直到切片符合要求。

⑧合上防卷玻璃板，并使其与刀刃对齐。

⑨确定切片厚度。

⑩旋转手轮并开始切片。

6.粘片

准备好涂有多聚赖氨酸的载玻片，待切出一条合适长度的带后，看准位置迅速将载玻片与切片平行靠近，使切片以一定的速度贴向载玻片且展开于玻片上;室温使切片自然干燥并粘在载玻片上，即可直接观察或染色观察。若需进行免疫反应，可在37℃烘干过夜;若需要长期保存，可置于－80℃中备用。

附:冰冻切片机的日常维护

1.实行专人管理和保养机器。每天不同的人使用时，要严格按照操作规程使用，每天工作结束后都要立即清扫箱内碎屑，这样不仅是为了干净美观，而且也是因为如果碎屑过多或落在温度传感器上，将会使切片机的显示温度与实际温度相差较大，严重时会使切片机的机械部分产生故障，影响机器的正常使用。

2.一般情况下，冰冻切片机昼夜24小时开机，温度设置在－20℃，尽量不要每天设置不同的温度，因为频繁的开启会影响压缩机的性能。冰冻切片机冷冻头的温度开启为随用随开，不用的时候及时关闭，这样会提高其使用寿命。

3.暂时不使用冰冻切片机时，要关好箱盖，锁住手轮，以防无关人员不小心碰撞造成不必要的损坏;而且也是为了防止误操作导致面板参数的改变，切片完成后应及时利用控制面板上的“键盘锁按钮”将键盘锁定。

4.每次冰冻切片机除霜前，一定要将排水管接上水盆，尽量将水排尽，然后把箱体用干纱布擦拭干净，不要留有水渍，最后敞开箱盖，待机器完全干燥后再开机。

5.夏天气温比较高时，要注意清扫机器后面散热器上的灰尘，因为灰尘会影响散热器的散热功能;机器要保持与墙壁一定的距离，以利对流散热，否则可能达不到机器设定的温度值;冰冻切片机所在房间必须安装空调保持恒温;要定期给冰冻切片机内的活动件润滑，保持活动灵活。

【思考题】

1.简述冰冻切片的一般操作步骤。

2.简述冰冻切片的快速包埋方法。