冷冻切片可用于新鲜、甲醛固定、低温冰箱冷藏等组织的切片。冷冻切片的操作一般经过取材、组织固定或不固定、速冻、冷冻切片、粘片或贴片、染色等步骤。
(一)冷冻切片取材
送检组织要尽可能新鲜,选取有代表性的组织,不能含太多水分,以免冰晶形成造成组织变形;也不能太大、太厚,大者难以切完整,厚者冰冻费时,厚度以1~2mm为宜,一般不超过3mm。用恒冷箱切片机切片,组织最好不固定。
(二)切片步骤
恒冷箱温冷冻切片机切片步骤如下。
1.冷冻切片机要始终处于运行状态,不能时开时关,以免影响机器寿命。温度一般调至-18~-25℃(夜晚可将切片机温度设定在-10℃)。不同组织冷冻温度有差异,脑、淋巴结、肝、脾、肾、睾丸等为-12~-16℃;肾上腺、甲状腺、肌肉、卵巢等为-12~-16℃;乳腺、皮肤、前列腺、子宫等为-22~-28℃。冷冻不足,切片可呈粥糜状或切不出来;冷冻过度,切片会呈碎屑状或出现条痕。
2.切片前先把组织托和适当数量的切片刀放于冷冻台上备用。
3.手术取下的新鲜组织不要固定(因固定过的组织易产生粗大冰晶,不利于切片,且影响染色),切成0.2cm的厚度,用清洁纱布吸干组织表面血水。
4.取出冷冻好的组织托,在其上加少量OCT(optimum cutting temperature)冷冻切片包埋剂或羧甲基纤维(也可用普通胶水),放上取好的组织速冻。
5.将组织托放置于箱内冷冻台上速冻1~2min,尔后将组织托固定在切片机机头上,调整机头位置使其恰好位于切片刀后方。
6.粗切修出切面后再细切几张,用毛笔刷去刀上的组织片,将微调刻度调在5~6μm。
7.调好防卷板,开始切片。要细心、准确地将防卷板调校至适当位置,切片时,切出的切片才能顺利地通过刀与防卷板间通道,平整躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板,取一载玻片附贴切片。用于附贴切片的载玻片应室温存放,不能存放于冷冻处。因为当附贴切片时,室温中的载玻片与冷冻箱中的切片之间有温度差,当它们碰在一起时,彼此间发生分子转移产生的吸附力使切片与载玻片牢固地附贴。
8.切片入甲醇或AAF液中固定30~60s,水洗后进行HE染色(见后文)。
9.冷冻切片完成后取下剩余组织固定做常规切片。
10.将冷冻机内的组织碎屑清扫干净,定期打开紫外线灯消毒。
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