植物组织石蜡切片技术

实验三十六　植物组织石蜡切片技术

【实验目的】

1.掌握石蜡切片技术的原理和方法。

2.掌握永久制片的制作过程，为研究植物的内部结构奠定基础。

3.学习植物内部结构的比较研究方法。

【实验原理】

石蜡切片技术是将植物材料经固定剂迅速固定，脱水剂脱去组织和细胞中的水分，再经细胞和组织透明、置换、石蜡包埋剂包埋，通过石蜡切片机切片后，可以进行形态结构的观察、特定物质的定位观察和原位杂交。石蜡切片技术可以保持细胞和组织中原有的形态结构特征，以及固定细胞内特定抗原决定簇，有利于研究和分析基因表达和蛋白质定位等问题。

【实验材料】

幼嫩植株，根据需要和季节选择植株各部分器官和组织。

【实验器材】

石蜡切片机，烘箱，显微镜，染色缸，小培养皿，镊子，毛笔，吸水纸，纱布，载玻片，盖玻片等。

【药品试剂】

10%番红水溶液，0.5%固绿(用95%的酒精配制)，酒精(100%、95%、80%、70%和50%)，二甲苯，蒸馏水，甘油，中性树胶等。

【实验方法】

石蜡切片法是显微技术上最重要、最常用的一种方法。它是把材料封埋在石蜡中，用石蜡切片机切出较薄的切片。对植物组织组织结构的观察研究，大多用石蜡切片。其过程如下:①固定;②洗涤;③脱水与硬化;④透明;⑤封埋;⑥切片;⑦粘片;⑧脱蜡;⑨染色;⑩脱水;〇11透明;〇12封片。

一、固定

1.固定

固定是用固定剂杀死细胞，使细胞的原生质凝固，保持细胞原有的结构。

采用的固定剂应穿透力强，能使细胞立刻致死，原生质全部凝固，同时不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色和观察。

2.种类

(1)简单固定液:

①酒精:即乙醇，常用纯酒精或95%酒精作固定液。酒精穿透力强，固定时间常在1小时以内; 70%酒精可作保存液。

【注意事项】

配制低浓度酒精需用95%酒精，不必用纯酒精。酒精为还原剂，不能与铬酸、锇酸、重铬酸钾等氧化剂配合。酒精可使核酸、蛋白质及肝醣等发生沉淀。

②福尔马林:即甲醛，固定用的浓度为4%～10%。甲醛也是强还原剂。不能与铬酸、锇酸等氧化剂配合。

【注意事项】

经甲醛固定后，材料变硬，通常不引起皱缩，但随后经过其他试剂处理时，常出现皱缩。所以甲醛一般不单独作固定剂，而与其他液体混合使用。

③醋酸:又叫冰醋酸。醋酸与水和酒精配成各种比例的溶液，浓度为0.2%～5%，也常与其他固定剂配合使用。

【注意事项】

醋酸穿透性很强，单独使用，有使原生质膨胀的作用，故常与酒精、甲醛等合用，醋酸为固定染色体的优良固定液，因此，固定染色体的固定液中，几乎都含有醋酸。

(2)混合固定液:

①FAA固定液:植物组织最常用的固定液。固定时间不受限制，并且固定后材料可以正常染色。

配方: 50%或70%酒精90ml(软材料用50%酒精，硬材料用70%酒精)，冰醋酸5ml，福尔马林5ml。

②卡尔诺氏(Carnoy's)固定液:多用于组织和细胞的固定，渗透极快，一般情况下，固定根尖和花药只需40～60分钟。固定后用95%酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入70%酒精中保存。

配方1: 15ml乙醇和5ml冰醋酸混合;

配方2: 30ml乙醇，5ml氯仿和1ml冰醋酸混合。

③纳瓦兴(Navaschjn's)固定液:植物制片技术中广泛应用。根据实验材料的种类，目前有很多的改良液，效果更好。

配方: 75ml 1%铬酸，5ml冰醋酸和20ml福尔马林混合。

二、洗涤

材料固定后，必须用水或酒精洗去固定液，减少固定液对材料的损伤。一般情况下用水溶液配制的固定液，特别是含有铬酸、重铬酸钾的固定液，一律用水洗;用酒精配制的固定液，用同浓度的酒清洗;如固定液中含有苦味酸，需要在70%酒清中停留稍久时间除去黄色。如用升汞固定的材料，须加碘液除去汞的结晶。

三、脱水与硬化

材料洗涤后，如果材料含有水分，水与石蜡不能相溶，通常用酒精脱水。材料由水入酒精中，由低浓度酒精渐至高浓度酒精。通常由30%、50%、70%、80%到90%酒精，每次须经半小时左右，具体的时间由材料大小而定。

【注意事项】

材料可放在70%酒精中长时间保存，但在高浓度酒精中不能过久。因为酒精能使材料硬化，过久则材料由硬变脆，切片时易于粉碎。

四、透明

材料脱水后，仍需除去酒精，脱酒精通常用二甲苯。材料由酒精入二甲苯，也需要渐次进行，先经酒精和二甲苯的混合液，再入纯二甲苯中，纯二甲苯须换一、二次才行。时间每次约半小时。二甲苯不仅可脱去酒精，并且具透明作用，所以又叫透明剂。

五、埋蜡

埋蜡是把材料包埋在石蜡里面，便于切片。石蜡必须纯净，熔点通常在48～56℃范围内，以熔点为52℃的石蜡使用更为方便。将石蜡置陶瓷钵中加热熔化;在进行封埋的全过程中，石蜡的温度以高于熔点2℃为宜，温度过低则石蜡凝固，温度过高则伤害实验材料。在包埋之前需要对实验材料进行浸蜡。浸蜡需要渐次进行。一般先用石蜡和二甲苯的混合液浸蜡，再用纯石蜡换1～2次，每次时间视材料大小而定，通常每次半小时。

六、切片

1.先将蜡块切成小块，粘固在小木头桩上。

2.安装切片刀，调好角度和切口部位。

3.根据需要调整切片厚度，进行切片。

七、粘片

通过加热使切好的蜡带平展在载玻片上，这一步骤叫粘片。目前，多数采用多聚赖氨酸作为粘贴剂，多聚赖氨酸常用PBS配制。目前市售的多聚赖氨酸多是已经溶解的10倍的母液，用无菌ddH₂O 1∶10稀释多聚赖氨酸母液。用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度回升至室温(一般为18～26℃)。将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液中5分钟(注意:增加浸泡时间不会提高包被效果)。然后在60℃烘箱干燥1小时，或室温18～26℃过夜干燥，待用。

用滤纸吸去载玻片上多余水分，同时以记号笔在玻片上编号以确定材料方位，放入42℃温箱中烘干，约12小时。

八、脱蜡

玻片烘干后，需要脱去石蜡才能染色。脱蜡一般常用二甲苯，再经酒精入水，然后染色。其顺序如下:二甲苯→等体积二甲苯和酒精混合液→100%酒精→95%酒精→85%酒精→70%酒精→50%酒精→30%酒精→水→染色。以上各步约需5～15分钟。

九、染色、脱水、透明和封片

1.番红和固绿双染法:用l%番红水溶液、0.5%固绿酒精(95%酒精)液双染。其步骤如下:切片脱蜡后逐步下降至水→1%番红水溶液1～12小时→35%酒精5分钟→50%酒精5分钟→70%酒精5分钟→80%酒精5分钟→0.5%固绿30秒钟→100%酒精30秒钟→100%酒精5分钟→等体积100%酒精和二甲苯混合液5分钟→二甲苯5分钟→封片。

【注意事项】

1.用番红和固绿组合染成的切片，其中木质化、栓化和角质化的细胞壁，被番红染成鲜红色，纤维素的细胞璧被固绿成绿色。维管束中木质部为红色，而韧皮部为绿色。

2.染色和脱色时间均不是绝对的，需要根据实验材料、切片厚度而异。

2.海氏铁矾-苏木精染色法:该种染色方法是在苏木精染色前，用铁明矾做媒染剂，在染苏木精后，用铁明矾液鉴定。其染色步骤:切片脱蜡后下降至水→铁明矾溶液30分钟～2小时→水5分钟→0.5%苏木精染色1～24小时→水5分钟→2%铁明矾溶液分色→流水10～30分钟→35%酒精5分钟→50%酒精5分钟→70%酒精5分钟→80%酒精5分钟→95%酒精5分钟→100%酒精5分钟→100%酒精5分钟→等体积100%酒精和二甲苯混合液5分钟→二甲苯5分钟→封片。

【注意事项】

1.铁明矾液为2%～4%的水溶液，此液需在用前数日临时配制。配制后不能见光，需放置于暗处，或用有色玻瓶盛装;也不能保存太久，大约2个月内有效。

2.苏木精液为0.5%的水溶液。此液配成后，需经1～2月，待它氧化成熟后方能使用，故必须先配制。苏木精在水中溶解很慢，约需10日才能完全溶解。若需用不急，可直接用蒸馏水配制;若想加速溶解，可先用酒精溶解，再加入蒸馏水定容。其配方: 0.5g苏木精; 10ml酒精; 90ml蒸馏水。

3.此染色法在细胞学及胚胎学制片上应用广泛，是显示细胞一般结构及细胞分裂的优良染色液，染色后可使染色体呈蓝黑-紫色，细胞质染成浅蓝色或浅灰色。在染色过程中所需注意的是，分色后用水洗净铁矾液，最好用流水，如无流水，需更多换水;若冲洗不净，将来会继续褪色。在铁矾液中分色，需时常取出切片在显微镜下检查，至细胞质染色很淡即止。

【思考题】

1.简述石蜡切片的一般步骤。

2.简述各种染色方法的优缺点。