切片前组织处理

(一)洗涤

1.目的 用冲洗剂将组织内固定液洗涤干净,避免组织内残留的固定液妨碍制片、染色。

2.方法及注意事项 冲洗剂应依固定液种类和性质选择。

(1)水溶性固定剂:甲醛溶液固定的标本需用流水冲洗。冲洗时将组织放入广口瓶,瓶口用纱布罩好并用线扎紧,防止组织块漏出。用一根粗细适当的胶管,一端接自来水,一端插入瓶底,使水从容器上面缓慢流出,也可将组织块放入洗涤筐,在水盆内冲洗。对于过小组织,如穿刺组织多次换水浸泡即可。冲洗时间与标本种类、组织块大小及固定时间有关。新鲜标本固定时间短,冲洗时间也相应缩短;固定时间长,冲洗时间也需延长。小块组织一般冲洗2~4h,大块组织和尸检组织一般冲洗24h。

(2)乙醇溶剂固定剂:一般无需洗涤,如果需要,可用与固定液浓度相同或略低的乙醇浸洗。不能用浓度相差大的乙醇,更不能用水直接冲洗。

(3)特殊固定剂:①含苦味酸的固定剂(苦味酸与甲醛混合液除外),应用70%乙醇浸洗,脱去苦味酸的黄色。洗涤时,乙醇中可加入少量饱和碳酸锂水溶液,直至乙醇不变色即可。②含有升汞的固定剂,流水冲洗后,放入70%或80%乙醇中洗涤,在乙醇中加少量用70%乙醇配制的0.5%碘酒以洗去组织内沉淀的汞,棕色消失后继续冲洗,直到脱汞乙醇无色,即组织内汞完全洗去,最后用5%硫代硫酸钠或70%乙醇脱碘。③含有铬酸、重铬酸钾、锇酸的固定剂:流水冲洗12~24h,也可用亚硫酸钠溶液或1%氨水溶液。

(二)脱水

固定和水洗后组织含有大量水分,而显微和超微标本制作用的包埋剂多为疏水性的物质,故包埋前必须置换出标本中的水分,才能使透明剂和包埋剂(如石蜡)渗入。脱水是用某些溶剂将组织内水分逐渐置换出来的过程。因此,脱水剂必须具备既能与水,也能与透明剂以任何比例混合溶解的特性。

1.常用的脱水剂及脱水方法

(1)乙醇:是最常用的脱水剂,脱水能力强,能硬化组织,又能很好地与透明剂二甲苯相溶。乙醇能使组织收缩、变脆,脱水时,应该先从低浓度开始,逐步递增浓度,以避免组织过度收缩。乙醇脱水必须脱净组织中的水分,并溶去脂肪,组织脱水不净会影响后续透明、浸蜡,致使切片质量下降,质量较差的切片染色时易脱片。

乙醇脱水过程通常要依次经过下列六缸乙醇:80%乙醇、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ及无水乙醇Ⅲ,每缸1~2h,脱水缸必须加盖。组织在低浓度乙醇(80%)中的脱水时间可以长些,在高浓度中要短。因低浓度乙醇穿透力很强,比高浓度更易渗透到组织内部。组织在低浓度乙醇中如脱水已充分,在高浓度中只需脱去从低浓度到高浓度之间的水分。高浓度乙醇渗透力不强,脱水时间延长无用,相反高浓度乙醇易使组织收缩、变脆,使后续切片和观察困难。

脱水时乙醇量要充足,应该是组织块的20~50倍。大、小标本脱水最好分开。第一缸乙醇浓度可随固定剂、组织大小及种类适当调整,大多数标本是从80%乙醇开始;细小柔软的组织脱水需缓慢,可从50%乙醇开始;需要做糖原或尿酸结晶染色的标本,为防止糖原和尿酸结晶在水中消失,要直接入无水乙醇固定,无需水洗和低浓度乙醇脱水。

无水乙醇固定的组织只需换一次无水乙醇脱水即可。AAF固定液固定的组织可直接置于95%乙醇开始脱水。醇性固定剂(如Carnoy液)固定的组织可置于高浓度或无水乙醇,但为了除酸,应多次换液。

脱钙的骨组织、实质性脏器的脱水过程宜短;疏松结缔组织、脂肪组织等脱水过程宜适当延长。含铬酸固定剂固定的组织脱水时间不宜过长;镀银染色用组织脱水时间应比不镀银的同类组织短。

乙醇脱水剂使用时间不宜太久,应适时更换。使用后的无水乙醇可加入硫酸铜吸收水分;当浑浊、变黄或滴于水中出现乳白色浑浊时,说明乙醇中已溶解了过量的脂类,应及时更换。

切片室内应常备浓度为70%、80%、85%的乙醇。配制它们应以95%乙醇为基液,加蒸馏水稀释,不必用价格较高的无水乙醇。将A%的高浓度乙醇配制成B%低浓度乙醇的方法如下:①取A%乙醇Bml注入量杯;②加入蒸馏水至总量到Aml,即可得到B%浓度乙醇。例如:用95%乙醇配制成70%乙醇。①取95%乙醇70ml;②加蒸馏水至95ml;即得到70%乙醇。其余类推,其他试剂的稀释也可参照此方法。

(2)丙酮:脱水速度快、脱水能力比乙醇强,兼有固定作用,脱水用可配成不同浓度;但组织收缩作用也比乙醇强,且价格高。很少单独使用,一般在快速脱水或固定兼脱水时用。

(3)正丁醇:脱水能力较乙醇弱,可与水、乙醇相混合,还能溶解石蜡。因此,不仅可以替代乙醇用于脱水,还能代替二甲苯起透明剂作用。用其脱水的优点是较少引起组织收缩、硬化等不良结果。一般用法是将组织脱水至90%乙醇后移入正丁醇脱水12~24h后浸蜡。正丁醇易挥发,吸入后可引起头痛,使用时应注意。

(4)叔丁醇:常温下为无色透明液体或固体(25℃以下),有樟脑香味,易溶于水、乙醇、乙醚和二甲苯,也是石蜡溶剂,有脱水兼透明作用,可单独或与乙醇混合使用。与正丁醇比,它不易使组织收缩、变硬,脱水后可不经透明直接浸蜡,常用作电镜标本制作时的中间脱水剂。

2.自动组织处理机 传统的手工作业不容易准确掌握大量组织块处理的时间,自动组织处理机不仅具有自动脱水功能,还能使组织块自动按程序浸入各种试剂脱水、透明、浸蜡,极大地提高了工作效率。自动组织处理机产品有多种,其结构和性能各异,使用前应熟悉机器的使用说明及注意事项,按程序操作。使用时,首先要在各试剂缸内按顺序放入相应试剂,依据组织块处理的具体要求,编好程序,即设定各步骤、所需时间、温度等,然后将组织块放入升降主轴提篮,确定无误后启动程序。机器调好后,不要随意变动,使用过程中要注意运行情况,温度、时间控制等是否正确,经常检查试剂的量和性质,并及时补充和更换。机器应置于干燥、通风、平稳处,按说明书要求做好维护。

(三)透明

1.概念与透明剂 在脱水后的组织中无水乙醇已取代了水,但无水乙醇也不能与石蜡相溶,需用既能与乙醇相溶又能与石蜡相溶的媒浸液,替换出组织中的乙醇。组织块在能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液中浸渍,折光系数发生改变而出现透明状态,此过程称为透明。起透明作用的媒浸液称为透明剂,常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等,均为石蜡的溶剂。通常组织先在纯乙醇与透明剂各半的混合液中浸渍1~2h,再转入纯透明剂浸渍。

2.二甲苯透明方法 二甲苯(xylene)是无色、透明、易挥发、不溶于水的液体,是最常用的透明剂,但有毒。透明时应注意:时间过短,透明不彻底,石蜡难于完全浸入组织;时间过长,组织会硬化变脆,不易切出完整切片。透明时间要根据组织块大小、器官特性及环境温度来定。室温高于15℃,透明时间可适当缩短;低于12℃,应适当延长。结构较坚韧组织(如子宫肌瘤)透明时间可适当延长;温度超过35℃,组织极易发脆。二甲苯透明方法为:两道二甲苯液,每道透明时间20~30min,小标本时间可相应缩短。

3.透明彻底的标准 组织呈棕黄色或暗红色琥珀样透明状为宜。如果组织进入二甲苯30min以后还不变色,或中心有白色,说明水分未脱净,应返回无水乙醇脱水。

4.试剂更换 更换试剂应以组织块数量为基础,定量更换(如每500ml二甲苯,每500个组织块更换1次),不要等到切片不好时再去更换。无水乙醇加入硫酸铜变蓝时,提示需要更换。

(四)浸蜡

浸蜡是指透明后组织置入熔化的石蜡内浸渍,使石蜡分子浸入组织的过程,又称石蜡渗透。石蜡是最常用的浸透剂,用其他浸透剂(如火棉胶、明胶等)渗入组织内部的过程称浸透或透入。用火棉胶代替石蜡,称为浸胶,其透明过程应变动。

常规制片浸蜡多选用熔点为56~58℃及48~50℃的纯净石蜡,过程有3道。第一道用熔点为48~50℃的石蜡;第二、三道用熔点为56~58℃的石蜡。浸蜡用温箱的温度应控制在比石蜡熔点高2~4℃。浸蜡过程中组织内的二甲苯不断挥发,石蜡不断进入直至饱和。浸蜡时间依据组织大小、厚薄而定,一般每道为1~2h。浸蜡时间过短,蜡没有完全渗入组织,组织会过软,切片困难;时间过长,温度过高,会使组织收缩,变硬变脆,也难以切出理想切片。浸蜡组织从第一道石蜡换到下一道的过程中要有一定时间间隔,以免将第一道中的二甲苯带入下一道影响浸蜡效果。石蜡更换一般采取倒去前一道石蜡,将后一道前移的方法。更换时间与脱水试剂更换相同(第一缸也可用硬脂酸石蜡1∶3浸蜡,可软化组织,特别适用于较韧、硬的组织。由于硬脂酸为弱酸性,对细胞核有媒染作用,会使核浆比鲜明,但易脱片,对疏松组织易散片)。

最好每天打开第一道石蜡容器盖子,让透明时带入的二甲苯挥发。浸蜡所用的石蜡中有杂质应过滤,以防其附着在组织上,造成切片刀刀刃损坏,切片破碎或划痕增多。

(五)包埋

浸蜡后的组织埋入石蜡或其他包埋剂制成组织内、外韧度和硬度相同、便于在切片机上夹持及切片的方块状蜡块的过程称为包埋。石蜡包埋法是最常用的包埋方法。包埋选用熔点56~58℃的石蜡(硬蜡),用硬蜡包埋的蜡块比用熔点低的软蜡包埋的蜡块要好切,不提倡在冬天使用软蜡。以免到了夏天,软蜡粘在一起,不利于蜡块保存。新蜡使用前应先反复凝固、融化,增加其韧性后使用。

1.常规石蜡包埋法

(1)一般程序:①将熔石蜡倒入一定形状的器皿(称包埋盒或包埋框);②用加热的镊子把浸蜡后的组织按一定方向埋入其中;③把组织号标签放到熔蜡一侧;④待包埋盒表面石蜡凝固后放入冷水中加速凝固;⑤蜡块完全凝固后,从包埋盒中取出,修整整齐。

(2)包埋面选择:①通常将组织最大面或病灶切面作为包埋面;②囊壁及胃、肠、血管等囊管状结构组织及皮肤、黏膜组织应以横断面作为包埋面,垂直包埋;③小块多个组织,应尽量聚拢包埋,并保证都在同一平面;④特殊标记的组织应按预先标记包埋面包埋。

(3)注意事宜:石蜡包埋成功的关键,一是平整,二是包埋面正确。包埋时,可用镊子轻压组织块拱起部,使之平贴于底部,镊子温度不能过高以免损伤组织;包埋盒(框)要比组织块大,以保证包入蜡块组织的四周都有蜡边;还应注意有无缝线、纸絮等异物,如有一定要取出。包埋用蜡应过滤,有杂质的石蜡,容易造成污染或刀刃损坏。包埋石蜡的温度要比组织的温度高3~5℃,以免倒入包埋盒后很快冷凝与包埋组织分离(特别是在气温较低时),动作更要迅速,否则容易导致组织与石蜡融合不佳。组织包埋后要与取材时的记录核对组织数量、形状,发现问题应及时解决。

2.液体标本的石蜡包埋 痰液、胃液、尿液、精液、胸腔积液、腹水等液体标本一般不用石蜡包埋和切片,但必要时也可用。①痰液、精液标本,可选有血或较为实性的可疑部分用擦镜纸包好,经AAF液或10%中性福尔马林固定,然后脱水、透明、浸蜡、包埋;②新鲜胃液、尿液、胸腔积液、腹水等液体标本,先倒去上面液体,取底部浑浊部分放入试管,以2000~3000r/min离心15min,取沉淀物用擦镜纸包好,经AAF液或10%中性福尔马林固定,然后脱水、透明、浸蜡及包埋。

3.快速石蜡切片法 快速切片诊断是在数十分钟或0.5h左右制成切片并做出诊断的方法,主要用于手术中决定手术切除范围和术式。适用于不具备冷冻切片条件的单位。制作快速石蜡切片时,切取的组织应薄而小,固定、脱水、浸蜡的全过程都要加温,此过程使用的丙酮、乙醇等试剂均易燃烧,有一定危险性。该方法目前已经很少使用。