组织冷冻切片

冷冻切片在病理组织学技术中应用广泛，主要用于临床病理快速诊断和一些特殊结构、特殊物质的形态学研究。对组织进行快速冷冻、切片进而做HE或其他特殊染色、酶组织化学染色、免疫组化染色尤其是免疫荧光染色，进行光镜观察。与常规石蜡切片相比，速度快，但有一定的局限性，技术（制片与诊断）及设备条件（切片机）要求高，尤其用于临床诊断要很好掌握其适用范围，需具有高年资、经验丰富的病理医师才能进行该项工作。

【基本原理】　冷冻切片的原理是将组织经过快速冷冻后结冰、变硬，然后切成薄片，贴附于载玻片上，经染色、封片，便可在显微镜下观察，进行病理诊断或特殊需要的研究。因其过程简单，只需20～30min便可制成冷冻切片，无需经组织的固定、脱水、透明和浸蜡等步骤。又由于组织不经溶剂处理，不受浸蜡温度影响，故而组织没有显著的收缩，组织细胞容易保持在生活时的状态，并能保存脂肪、类脂及各种酶的活性。因此冷冻切片除在手术中病理诊断有着重要作用外，对于许多研究工作也是必要的。如神经组织的特殊染色，含脂肪组织的特殊染色、组织化学染色、免疫荧光、免疫酶标染色等是很理想的切片方法。

【制备方法】　常见的冷冻切片机有低温厢式恒冷冷冻切片机、二氧化碳冷冻切片机和半导体冷冻切片机，其中，低温恒冷冷冻切片机制冷快而均匀，切片薄，质量好，高质量的切片甚至可与石蜡切片相似，故以低温恒冷冷冻切片机为例介绍冷冻切片的制片方法。

（1）使用时提前2h开启电源，按预切组织的种类将温度调设在相应的温度，一般－23℃左右（设有自动除霜的切片机通常将机器温度设为－10℃，使用时提前将温度设在相应的温度，可缩短降温时间）。

（2）安装切片刀：目前多为一次性刀片，调整切片刀的角度，约15°。

（3）组织取材不宜太厚，以0．5cm为宜，也不宜太大，常以1cm×0．8cm×0．5cm为宜，否则会延长冷冻的时间。

（4）取出组织样品托，组织块平放于样品托上，滴加包埋剂，通常包埋剂要滴到组织上面，让其自然向下流到组织底部，防止包埋时形成气泡，一般包埋剂把组织块完全盖住最好。放到切片机的冷冻台上冷冻。特别小的组织应先在组织样品托上滴加一些包埋剂，冷冻凝结成1个包埋台（堆）最好将其切平，把细小的组织放到包埋剂台上再滴加包埋剂将小组织包埋，切片时防止刀刃触到样品支持器上。

（5）将冷冻好的组织包埋块夹在切片机样品夹持座上。调整包埋块和刀刃的距离，启动粗调进退键，修切组织。当修切出组织最大面后，停止修切。

（6）设定欲切片的厚度（微米）。根据不同的组织和不同需要确定切片厚度，细胞密集的组织一般5μm左右。纤维多、细胞稀疏的组织可稍厚一点，可以＞5μm。一般切片厚度5～7μm。

（7）调整防卷板到合适的位置，使切片能顺利通过刀和防卷板之间的缝隙。当切出平整的组织片时，组织片平整铺在刀片上，掀起防卷板，将组织片贴于载玻片上。

（8）切片前准备好需要的固定液，一般用甲醇－冰醋酸液固定：95%甲醇100ml，冰醋酸3ml，常规病理诊断切片固定30～60s，染色前水洗。

【注意事项】

（1）冷冻切片机应保持干净，尤其是防卷板、切片刀和持刀架应经常用毛笔或柔软的纸张清除残余组织碎片。必要时每切完一张切片后就要擦1次，因为切片时，包埋剂与碎组织很容易贴附在防卷板和切片刀上，这样切片容易出现皱褶，或组织片断裂，很难获得完整的切片，还可能相互污染。

（2）如果几个病例同时做冷冻切片，应将组织分别放于不同的样品托上，标好号放到冷冻台上冷冻，然后按顺序进行切片，并在切片上标记该组织的编号。防止张冠李戴。

（3）组织冷冻之前，需要根据组织的形状、观察需要确定包埋方向。长条形组织要横向包埋，成“一”字形。这种方位有利于切片，切片时组织不会皱到一起，且容易展片。

（4）冷冻切片的组织一般不需要固定，如果组织事先已经固定，然后做冷冻切片，在做冷冻切片之前，需要经过蔗糖处理，然后再进行冷冻切片，蔗糖处理的主要目的是减少冰晶的形成。

（5）切片时发现组织冷冻过度，可将冷冻包埋的组织块连同样品托取出来，在室温停留片刻，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，还可以把冷冻温度稍微调高一点。来缓解冷冻过度的程度，让组织尽快达到合适的切片温度。

（6）贴附冷冻切片的载玻片，应室温下放置备用，不必冷藏或冷冻，因为贴附切片时，室温下的载玻片与冷冻箱中的切片有一定的温差，当温度较高的载玻片与温度较低的切片接触时，冷冻切片很容易贴到载玻片上。而冷藏或冷冻的载玻片反而不容易贴牢，易脱片且容易产生气泡。

（7）不易做冷冻切片的标本有：具有传染性的标本（例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等）；疑为恶性淋巴瘤的标本；过小的标本（检材长径≤0．2cm者）；脂肪组织、骨组织和钙化组织；需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤标本；主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤标本。

【温度选择】　见表1－2。

表1－2　不同组织冷冻切片时温度的选择

【切片固定】

1．固定液　常规染色选用甲醇－冰醋酸液固定，如有特殊要求按需要选择固定剂或不固定直接染色。免疫组织化学染色可选用4%多聚甲醛，以保存酶为主时多选用冷丙酮。糖类物质选用Carnoy或以乙醇为基础的固定液。

2．固定时间　常规冷冻切片固定0．5～2min到数分钟不等，根据切片的组织类型、厚薄、室温而定，染色前水洗。选用穿透性能好的固定液仅需数秒就可以达到固定目的。

【染色方法】　下面是临床病理诊断中快速冷冻切片HE染色的方法和步骤。

（1）贴附好的冷冻切片固定0．5～1min。

（2）自来水洗。

（3）Harri苏木素3～5min。

（4）自来水洗。

（5）0．5%盐酸乙醇分化。

（6）氨水中反蓝20s。

（7）1%伊红水溶液10～20s。

（8）脱水，透明，中性树胶封固。

上述染色步骤由于时间不同，可根据染液、室温等自行调整。