农作物的组织培养技术

任务一　农作物的组织培养技术

植物组织培养技术在农作物上主要应用于育种和良种繁育方面，其次应用于无性繁殖作物的脱毒、快速繁殖以及种质的保存方面。

一、小麦的组织培养技术

小麦（Triticum aestivum，见图7-1）是小麦系植物的统称，为被子植物门、单子叶植物纲、禾本目、禾本科、小麦属的植物。小麦是三大谷物之一，是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物。小麦起源于中东新月沃土（Levant）地区，是世界上最早栽培的农作物之一。在中国种植面积仅次于水稻，是中国人民的主要粮食作物之一。小麦磨成面粉后可制作面包、馒头、饼干、面条等食物；发酵后可制成啤酒、酒精或生物质燃料。小麦富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸、维生素A及维生素C等。

图7-1　小麦

（一）外植体选择

在小麦的组织培养中，几乎各种器官、组织均曾被用作外植体进行离体培养，如小麦的根、幼叶、种子、顶端分生组织、花药、原生质体、幼穗、成熟胚以及幼胚等。其中，研究最多的是小麦幼胚作为外植体进行离体培养。

小麦幼胚愈伤组织诱导率很高，通过对愈伤组织的直接或间接筛选，可以发生定向变异，主要体现在农艺性状（如株高等）、抗性和品质方面，故小麦幼胚培养主要体现在新品种的选育上。

（二）无菌外植体的获得

取开花后14～20 d的小麦幼穗，剥出种子，用70%的酒精消毒2 min，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒20 min，用无菌水冲洗4～6次，无菌条件下用镊子和解剖针将幼胚取出，幼胚大小为1～1.5 mm，盾片向下接种。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；芽簇块诱导培养基为① MS+2，4-D 0.8 mg/L；芽簇块增殖培养基为②MS+2，4-D 0.2～0.4 mg/L；芽簇块成苗培养基为③MS+KT 1.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.6%，pH为5.8。诱导和成苗均在光照下进行，光周期为16 h光/8 h暗，光照度控制在1 000～1 500 lx，培养温度为（28±1）°C。

（四）芽簇块诱导与增殖

将外植体幼胚接种到培养基①上培养，幼胚先产生淡黄色致密的类似愈伤组织的结构，随后在该结构的表面出现大量绿色微芽点，培养14 d后，芽点逐渐长成芽簇块。将诱导出的芽簇块分割成小块，转接到增殖培养基②上，培养30 d后，培养基上芽簇块的微芽大多已成苗。

（五）芽簇块成苗生根

将增殖培养基②上的芽簇块分割成5 mm左右的小块，接种于成苗培养基③上，培养21 d后，可100%成苗，生根效果好，每个成苗的微芽基部都有根，每芽簇块平均成苗数为4.4个，每簇平均生根数4.2个，生根率96.7%，且长成的苗可直接移栽。

二、水稻的组织培养技术

水稻（Oryza sativa，见图7-2）为被子植物门、单子叶植物纲、禾本目、禾本科、稻属的植物，也是稻属中作为粮食的最主要、最悠久的一种，又称为亚洲型栽培稻。水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。按照不同的方法，水稻可以分为籼稻和粳稻、早稻和中晚稻、糯稻和非糯稻。水稻所结子实即稻谷，稻谷（粒）去壳后称大米、香米、稻米。水稻不仅是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国主要的粮食作物。全世界有近一半的人口以稻米为食。大米的食用方法多种多样，有米饭、米粥、米饼、米糕、米酒等。水稻除可食用外，还可以酿酒、制糖、作工业原料，稻壳、稻秆还可作为饲料。我国水稻主产区在东北地区、长江流域和珠江流域。

图7-2　水稻

（一）外植体选择

水稻的组织培养中，外植体主要有花药和成熟胚。

水稻花药离体培养作为一种新的育种手段，在水稻育种中得到了广泛应用。我国是世界上首先将水稻花药培养品种应用于生产的国家，现已育成一批优质高抗的水稻优良品种，并取得了较好的经济效益和社会效益。花药培养诱导出的单倍体，表现出双亲性状的各种重组类型，通过自然加倍或人工加倍，可以在当代获得稳定的纯合二倍体，大大加快了育种速度。

（二）无菌外植体的获得

穗子保留2片叶片，用75%的酒精清洁表面后，用无菌水冲洗3次，然后在8 °C的低温下处理7～10 d。挑选花粉母细胞处于单核中晚期的小穗，先用1%的NaClO灭菌15 min，再用3%的H2O2灭菌10 min，用无菌水冲洗3～4次，取花药为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

1.诱导培养基

① N6+6-BA 0.5 mg/L+NAA 2.0 mg/L+PAA（苯乙酸）10.0 mg/L+0.25% gelrite+5.4%麦芽糖。

2.分化培养基

② MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+0.25% gelrite+3%蔗糖。

上述培养基①、②增加谷氨酰胺500 mg/L、水解酪蛋白500 mg/L、脯氨酸100 mg/L，pH调至5.8。培养温度为（25±1）°C，光照时间为16 h/d，光照度为2 000 lx。

（四）愈伤组织诱导及分化成苗

将灭过菌的花药接种到培养基①中，在（25±1） °C的温度条件下进行暗培养。愈伤组织诱导率和分化率变化范围分别为10.5%～34.9%和15.6%～46.6%。当愈伤组织长至1～2 mm时，转至分化培养基上光照培养，光照度为2 000 lx，光照时间16 h/d。诱导愈伤组织可以不更换培养基，先在愈伤组织表面形成绿点，然后从绿点分化出芽，进而长成植株。

一般花药接种后30～40 d内开始出现绿芽点，然后芽尖迅速生长，经15～20 d即可长成8 cm以上的小植株。再生植株绝大多数具有发达的根系，因而可直接移栽到土壤中。接种45 d后，尚未在诱导培养基上分化的愈伤组织转移到分化培养基②上，它们能在分化培养基②上分化成苗。花药接种后40～60 d，在浓度为40 mg/L的PAA中诱导花药愈伤组织直接再生小植株，可进一步提高植株的再生率。

水稻花药培养的成苗率低长期以来是个难题。籼稻花药培养的难度尤为突出。传统的培养方法一般包含两个培养阶段，即高生长素培养基上的去分化阶段和高细胞分裂素培养基上的再分化阶段。近年来，国内外科学家正致力于建立一种更为简便、快速、高效、一步成苗的培养方法，即用同一种培养基实现愈伤组织诱导和分化而直接成苗获得再生植株。研究发现，采用PAA和6-BA、NAA配合能有效诱导水稻花药愈伤组织直接分化成苗，对于籼稻效果尤为明显，并且PAA的浓度效应实验还发现PAA具有很大的诱导直接成苗的潜力，为研究水稻花药培养，促进高频率直接成苗的新途径奠定了基础。

三、玉米的组织培养技术

玉米（Zea mays，见图7-3）为被子植物门、单子叶植物纲、禾本目、禾本科、玉蜀黍属一年生草本植物。玉米是世界上分布最广泛的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦和水稻而居第三位，是全世界总产量最高的粮食作物。玉米在中国的播种面积很大，分布也很广，是中国北方和西南山区及其他旱谷地区人民的主要粮食之一。中国年产玉米占世界第二位，其次是巴西、墨西哥、阿根廷。玉米味道香甜，可做各式菜肴。此外，玉米可用于生产乙醇，对于解决当前世界能源危机有着重要意义。

图7-3　玉米

（一）外植体选择

茎尖、幼穗、花药、叶片、未成熟合子胚、成熟胚及其胚根、胚轴等材料均可作为玉米组织培养的外植体。

（二）无菌外植体的获得

为获得无菌种子苗，把玉米种子先在70%的酒精中清毒8～10 min，然后在0.1%的HgCl2溶液中消毒10 min，用无菌水冲洗4～5次，选健壮种子接种于MS培养基①上，置于25 °C下促其萌发，7～8 d后形成无菌苗。待幼苗伸长至3～5 cm时，剥去其胚芽鞘及2～3片幼叶，取自上胚珠基部至顶端分生组织2～3 mm的茎尖为外植体以供接种。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；种子萌发培养基：① MS；胚性愈伤诱导培养基：② MS+6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L+水解酪蛋白（CH）500；分化培养基：③ MS+6-BA 0.5～1.0 mg/L+IBA 0.4 mg/L+水解酪蛋白（CH）500；生根培养基：④ MS+IBA 0.8 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH为5.8～6.0。培养温度为（25±1）°C，光照时间为16 h/d，光照度为2 000 lx。

（四）胚性愈伤组织诱导

取灭过菌的玉米茎尖2～3 mm垂直接种到诱导培养基②上，6～8 d时，芽尖生长点周围出现不规则膨大，愈伤组织开始形成，随着愈伤组织不断产生，芽尖及其周围部分的体积逐渐增加，这时及时去掉茎尖生成的幼叶，否则会抑制愈伤组织的生长。培养1个月左右，产生的愈伤组织一般呈现鹅黄色，表面较光滑或具有表皮毛，较坚硬，难以被镊子夹碎。因此，继代培养时需用解剖刀切割分块，去掉没有愈伤组织分化的上胚珠基部，然后将愈伤组织块接种于继代培养基上即诱导培养基②上，并使切口处向下，7～8 d后，肉眼可见愈伤组织开始增殖。

（五）丛生芽的诱导

将胚性愈伤组织转移到分化培养基③上，20 d后，愈伤组织块表面即可形成肉眼可见的密集丛生芽群。

（六）生根与移栽

在解剖镜下仔细分离幼芽，转移到分化培养基③上，再生长7～10 d，然后转移到生根培养基④上，光照2～3周，于25 °C条件下即可得到生根苗。将生根苗移栽于蛭石中，培养2周后，即可定植于大田。

四、甘薯的组织培养技术

甘薯（Ipomoea batatas，见图7-4）为被子植物门、双子叶植物纲、茄目、旋花科、番薯属一年生草本植物。甘薯原产热带美洲，主要产区分布在北纬40°以南。栽培面积以亚洲最多，非洲次之，美洲居第3位。甘薯在16世纪末从南洋引入中国，在中国分布很广，以淮海平原、长江流域和东南沿海各省最多。甘薯块根中含有 60%～80% 的水分、10%～30%的淀粉、5%左右的糖分及少量蛋白质、油脂、纤维素、半纤维素、果胶、灰分等，且甘薯中蛋白质组成比较合理，必需氨基酸含量高。此外，甘薯中含有丰富的维生素（胡萝卜素，维生素A、B、C、E），其淀粉也很容易被人体吸收。甘薯的块根可供食用、酿酒或作饲料。

图7-4　甘薯

（一）外植体选择

甘薯的叶片、花药、块茎顶芽等均可作为外植体进行组织培养，但以甘薯茎尖为外植体进行组织培养居多。

（二）无菌外植体的获得

用甘薯的薯块进行催芽，取其顶端部分3 cm左右，剪去用肉眼能看见的叶片，用清水洗净。将洗净后的顶端，置于2% 的次氯酸钠溶液中消毒8 min，在70% 的酒精中浸泡10 s，再用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min，用无菌水冲洗4～5次，在解剖镜下无菌操作切取带有1～2个叶原基、大小在0.2～0.5 mm的茎尖分生组织作为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为MS；茎尖培养基为①MS+6-BA 0.1 mg/L+IAA 0.2 mg/L；②1/2MS+GA3 0.5 mg/L；生根培养基为③1/2MS+IBA 0.5～1.0 mg/L+GA3 0.4 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH为5.8～6.0。培养温度为（26±1）°C，光照时间为14 h/d，光照度为2 000 lx。

（四）茎尖培养

将灭过菌的茎尖接种到培养基①中，待茎尖生长变绿并适当愈伤化，转移到培养基②中，使之生根进一步分化成苗。将分化的芽苗转移至培养基③中，3 d后，茎尖开始膨大，有大量愈伤组织形成，且生长迅速，6 d左右直径达到0.2～0.4 cm，随即出现新根，8 d后，达到生根高峰，接着芽开始生长。随着根系生长迅速，根数增多，一般为3～5条，且健壮粗大，因而植株生长速度相对较快。接种约15 d后，部分植株的叶片可达5～7片，根3～4条。采用加入GA3的茎尖培养基（有刺激器官伸长的作用），使有些发育不良的茎芽继续生长，较容易生成完整植株。

（五）炼苗移栽

待苗长至3～4 cm，具有4～5片叶时便可移栽，把试管苗在温室中炼苗（见图7-5）1周后，取出小苗，洗净根部培养基，栽在蛭石、河沙、腐殖土混合的基质中（见图7-6），压紧根部，浇透水，注意盖膜保湿、保温，其间可用1/2MS营养液和0.2%的KH2PO4叶面喷肥促苗生长。

图7-5　甘薯炼苗

图7-6　甘薯移栽

五、马铃薯的组织培养技术

马铃薯（Solanum tuberosum，见图7-7）为被子植物门、双子叶植物纲、管状花目、茄科、茄属一年生草本植物。马铃薯原产于南美洲安第斯山地的高山区，其主要生产国有中国、俄罗斯、印度、乌克兰、美国等，中国是世界上马铃薯总产量最多的国家。马铃薯是全球第三大重要的粮食作物，仅次于小麦和玉米。马铃薯是一种粮菜兼用型的蔬菜，与稻、麦、玉米、高粱一起被称为全球五大农作物。马铃薯含有丰富的维生素A和维生素C以及矿物质，优质淀粉含量约为16.5%，还含有大量木质素等，被誉为人类的“第二面包”。

（一）外植体选择

马铃薯的块茎可作为茎尖培养的外植体。

（二）无菌外植体的获得

取优良单株马铃薯休眠块茎数个，洗净后进行催芽。用GA3溶液浸泡24～36 h，然后进行热处理。热处理的具体方法如下：把催芽的块茎从恒温箱内取出，放入光照培养箱内进行热处理，前3 d培养温度为35 °C，之后调整为35～37 °C，光照时间为12 h/d，光照度为2 000 lx，共处理28 d。

图7-7　马铃薯

取经过热处理后的发芽块茎的茎尖1～2 cm，用清水洗净，用75%的酒精浸泡15 s，取出后用无菌水冲洗2次，再浸入5%的NaClO溶液中消毒20 min，无菌水冲洗4次，最后用0.1%的HgCl2溶液消毒约8 min，用无菌水冲洗4～5次，用无菌滤纸吸干水分，切取带有1～2个叶原基、大小在0.2～0.5 mm的茎尖分生组织作为外植体以供接种用。

（三）培养条件及温光条件

基本培养基为MS；芽诱导培养基为①MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L，②MS+GA3 0.5 mg/L；芽增殖及生根培养基为③MS（可适量添加CCC）。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH为5.8±0.1。培养温度为（25±1） °C，光照时间为12～14 h/d，光照度为2 000 lx。

（四）芽的诱导与增殖

将灭过菌的茎尖接种到培养基①中，于温度为18～25 °C、光照时间为10～14 h/d、光照度为2 000 lx下培养，2周后，茎尖明显增大、变绿，45 d后，转接到培养基②中，以后，每隔20 d转接1次直到成苗。将诱导的试管苗转移至培养基③中进行继代增殖培养，25 d左右可继代1次，增殖系数为4～5，继代时也可生出根来形成完整植株。

（五）炼苗移栽

待苗长至3～4 cm，具有4～5片叶时便可移栽。移栽前先把试管苗带瓶移到温室中炼苗1 周，若光照太强，可加一层遮阳网。移栽时，仔细用镊子取出小苗，洗净根部培养基，栽在蛭石、河沙、腐殖土（111∶∶）混合的基质中，密度为5 cm×5 cm。注意压紧根部，浇透水。前3 d可盖膜保湿、保温。1周后，可用1/2MS营养液和0.2%的KH2PO4叶面喷肥促苗生长，每隔5 d喷1次，移栽成活率可达90%以上。

六、大豆的组织培养技术

大豆（Glycine max，见图7-8）为被子植物门、双子叶植物纲、豆目、蝶形花科、大豆属一年生草本植物。大豆古称菽，是黄豆、青豆、黑豆和杂色豆的总称，原产中国。全国各地均有栽培，集中产区在东北平原、黄淮平原、长江三角洲和江汉平原，也广泛栽培于世界各地。大豆是中国重要的粮食作物之一，已有5 000年的栽培历史，对保障粮食生产安全有着重要意义。现种植的栽培大豆是由野生大豆驯化而来，约有1 000个大豆栽培品种。大豆是蝶形花科植物中最富有营养而又易于消化的食物，是蛋白质最丰富最廉价的来源。目前，大豆仍然是世界上许多地方人和动物的主要食物。

图7-8　大豆

（一）外植体选择

大豆的叶片、单个细胞、原生质体、种子苗子叶节等均可作为外植体进行组织培养。

（二）无菌外植体的获得

以种子苗子叶节作为外植体为例。取大豆种子，用 70% 的酒精表面消毒1 min，再用0.1%的HgCl2溶液消毒7 min，用无菌水冲洗4～5次，倒入60 mL无菌水中浸泡过夜。浸泡后的种子剥皮接种于培养基①上，培养1～2 d促使萌发。将已萌发的种子取出，切下长出下胚轴的子叶节区，留下胚珠4 mm，再从子叶中间纵切，保留子叶为外植体以供接种用。

（三）培养基及温光条件

基本培养基为B5；种子萌发培养基：1/2B①5；芽的诱导培养基：B②5+6-BA 9.0 mg/L+ IBA 0.2 mg/L；液体培养基：③B5（150 r/min）；固体培养基：④B5+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L；生根培养基：⑤1/2B5+IBA2.0 mg/L。

上述培养基均加蔗糖3%，琼脂0.7%，pH为5.8～6.0。培养温度为（26±1） °C，光照时间为16 h/d，光照度为3 500 lx。

（四）芽的诱导与分化培养

将外植体子叶近轴面植入培养基②上。15 d后转入培养基③上，振荡培养150 r/min，温度为（26±1） °C，培养3 d，然后转入培养基④中暗培养，第一天玻璃化现象严重，第5 d开始逐渐减轻。10 d后外植体的子叶节开始由水渍状的翠绿色转变成绿色，叶片上的茸毛可用肉眼看到。继代3次后玻璃化现象开始逐渐消失，从子叶节处诱导出大量丛生芽并且分化成苗。再转入生根培养基⑤中进行生根培养，培养2周后，基部分化出幼根，形成完整植株。