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技术的原理和方法

时间:2022-04-06 理论教育 版权反馈
【摘要】:ELISPOT技术的基本步骤包括:①将适量捕获性单抗或抗原预包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板,并在4℃孵育过夜。目前,使用的检测抗体标记方法和显色系统有生物素、荧光素、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶显色系统等。

ELISPOT技术采用类似于ELISA的酶学方法,将抗原或特异性单抗预先包被在贴有PVDF(聚偏氟乙烯)膜或硝酸纤维素膜的96孔微孔板上,将经适量抗原刺激后的免疫细胞加入微孔中,于37℃5%CO2孵箱中孵育,捕获抗原或抗体与免疫细胞分泌出的抗体或细胞因子结合,将细胞和未结合的成分洗掉后,加入酶标记的单抗或多克隆抗体,与被检测的抗体或细胞因子结合。加入底物后,可在有相应抗体、细胞因子的位置产生有色斑点,每个斑点代表一个分泌抗体或细胞因子的细胞。

ELISPOT技术的基本步骤包括:①将适量捕获性单抗或抗原预包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板,并在4℃孵育过夜。将板用PBS洗涤3遍,再用含10%胎牛血清(fetal calf serum,FCS)的培养基封闭,室温下孵育至少1h。FCS可以封闭所包被抗体的Fc受体以降低非特异性反应;②将细胞样品如外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell,PBMC)、经纯化的CD8T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC,用含10%FCS的培养基稀释至(5×10)~(2×10)个/孔,分别加入ELISPOT板微孔中,再加入特异的刺激物,如多肽或基因表达产物、提取的抗原等,阴性对照孔中只加入培养基,阳性对照孔中加入植物血凝素(2μg/ml PHA)或阳性多肽,于37℃5%CO2孵箱孵育24~48h;③用含0.01聚山梨醇-20的PBS洗涤6次,加入酶标记的检测单抗或多抗,孵育3h;④洗涤6次后,加入酶底物室温下显色20~30min;⑤弃去显色液,用去离子水清洗ELISPOT板,室温干燥后即可用解剖显微镜或计算机辅助成像分析系统(如德国Bio-Sys生物医疗仪器公司的Bioreader图像分析仪)计数斑点数,并用斑点形成单位(sfu/L)记录结果。每一个斑点代表一个特异分泌细胞因子或抗体的细胞,这样就可以确定样品中抗原特异性的分泌细胞因子或抗体的细胞数量。

目前,使用的检测抗体标记方法和显色系统有生物素、荧光素、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶显色系统等。显微镜下人工计数显色斑点,由于斑点大小和形状差别很大,结果存在较大的计数误差。借助计算机成像和图像处理软件,可更准确、快速地记录ELISPOT的结果,尽量减少计数误差。

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