选育与培养

任务2　发酵工业菌种的分离、选育与培养

在发酵技术中，微生物菌种的分离、选育与培养工作是整个生产过程的核心工作，菌种的好坏将直接影响到发酵的成败，因此如何对微生物菌种进行分离纯化，如何选育出高产的菌株，都是发酵生产中必须考虑的关键的问题。

我国幅员辽阔，各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大，微生物的资源非常的丰富，这为自然界中各种微生物提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多，广泛分布于土壤、水和空气中，尤以土壤中最多。自然界中的微生物估计不少于几十万种，但目前已为人类研究及应用的不过千余种。有的微生物从自然界中分离出来就能被利用，有的需要对分离到的野生菌株进行人工诱变，得到突变株才能被利用。由于微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础，故采用各种不同的筛选手段，挑选出性能良好、符合生产需要的纯种微生物是工业育种的关键一步。

一、工业生产常用的微生物

1．细菌

细菌（bacteria）是自然界分布最广、数量最多的一类微生物，属单细胞原核生物，以比较典型的二分裂方式繁殖。工业生产常用的细菌有：枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、短杆菌、棒状杆菌、节杆菌。用于生产淀粉酶、乳酸、氨基酸、乙酸等。

2．酵母菌

酵母菌（yeast）为单细胞真核生物，在自然界中普遍存在，主要分布于含糖较多的酸性环境中，如水果、花蜜和植物叶子以及果园土壤中。酵母菌多为腐生，常以单个细胞存在，以芽殖形式进行繁殖，母细胞体积长到一定程度时就开始形成芽体。芽体长大的同时母细胞缩小，在母、子细胞间形成隔膜，最后形成同样大小的子细胞，如果子芽不与母细胞脱离就形成链状细胞，称为假菌丝。在发酵生产旺期，常出现假菌丝。工业上用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，分别用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及生产食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。

3．霉菌

霉菌（mould）不是一个分类学上的名词。凡生长在营养基质上形成绒毛状、网状、絮状菌丝的真菌统称为霉菌。霉菌在自然界分布很广，它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧菌，多腐生，少数寄生。霉菌的繁殖能力很强，它以无性孢子和有性孢子方式进行繁殖，多以无性孢子繁殖为主。工业上常用的霉菌有藻状菌纲的根霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等，可用以生产多种酶制剂、有机酸、抗生素及甾体激素等。

4．放线菌

放线菌（actinomycetes）因菌落呈放线状而得名。它是一个原核生物类群，分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较广。放线菌主要以无性孢子进行繁殖，也可借菌丝片段进行繁殖。它的最大经济价值在于能产生多种抗生素。从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。工业上常用的放线菌主要来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属等。

5．担子菌

所谓担子菌就是人们通常所说的菇类（mushroom）微生物。担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、抗癌药物的开发。近年来，日本、美国等一些科学家对香菇的抗癌作用进行了深入的研究，发现香菇中1，2－葡萄糖苷酶及两种糖类物质具有抗癌作用。

6．藻类

藻类（alga）是自然界分布极广的一类自养微生物资源，许多国家已把它用作人类保健食品和饲料。培养螺旋藻，按干重计算每公顷可收获60t，而种植大豆每公顷才可收获4t；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大豆的28倍。有的国家已建立培植单胞藻的农场，每年每公顷栽培场所培植的单胞藻按5%干物质为碳水化合物（石油）计算，可得60t石油燃料。国外还有从“藻类农场”获取氢能的报道，大量培养藻类，利用其光合放氢来获取氢能。

工业上常用的微生物见表1－1。

表1－1　工业上常用的微生物

续　表

二、工业微生物菌种的选育

良好的菌种是微生物发酵工业的基础。在应用微生物生产各类食品时，首先遇到的是选种的问题。要挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取，另一方面可根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三，当菌种的性能下降时，要设法使它复壮。最后，还要有合适的工艺条件和合理、先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。

1．自然界工业菌种筛选程序

自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、纯种分离筛选、生产性能测定等。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。

（1）采样

菌种的采样以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物、腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中、雨量不多的初秋为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐殖质，根系及根系周围区域，海底水、泥及沉积物，植物表皮及各部分，阴沟污水及污泥，反刍动物第一胃内含物，发酵食品等。

具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损坏土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应储存于4℃下，但储存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，样品中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存样品会使嗜冷菌数量明显降低。

在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去黏附在根上的土壤，然后用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。

在采集水样时，将水样收集于100mL干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30～50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者于4℃下储存。

（2）增殖培养

一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但有时样品中所需要的菌类含量并不是很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所需要菌种的数量以增加分离的概率，可以通过选择性的配制培养基（如添加营养成分、抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或被淘汰。对革兰氏阴性菌有选择的培养基（如结晶紫营养培养基、红－紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等）通常含有5%～10%的天然提取物。在分离细菌时，向培养基中添加浓度一般为50μg／mL的抗真菌制剂（如放线菌酮和制霉素），可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常向培养基中加入1～5mL天然浸出汁（植物、岩石、有机混合腐殖质等的浸出汁）作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌。放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物（如几丁质），因此，大多数放线菌的分离培养是在贫瘠或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的。此外，为了对某些特殊类型的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素（如新生霉素）。在分离真菌时，利用低碳氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和鉴定。在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成。抑制细菌的另外一些方法有：在使用培养皿之前，将培养皿先干燥3～4d；降低培养基的pH，或在无法降低pH时加入1∶30000玫瑰红。抑制细菌的生长，有利于下阶段的纯种分离。

（3）培养分离

通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态，因此必须进行分离、纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点，同时必须进行纯种分离。常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。划线分离法要首先倒培养基平板，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0．1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经观察确认菌落特征和细胞特征后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。

对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0．1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0．1%的山梨糖及0．01%的蔗糖，利于单菌落的分离。

（4）筛选

经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过用三角瓶进行小型发酵试验得到适合于工业生产用的菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。

2．诱变育种

从自然界直接分离的菌种，发酵活力一般是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。采用物理和化学因素促进其诱发突变，这种用人工的方法处理微生物，使它们发生突变的育种方式就是诱变育种，它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种具有极其重要的意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能，而且能改进产品的质量、扩大品种数量和简化生产工艺等。诱变育种与其他育种方法相比，具有操作简便、速度快和收效大的优点。诱变育种包括出发菌种选择、诱变处理和筛选突变株三个主要步骤。

（1）选择出发菌种

用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌种。在诱变育种中，出发菌株的选择会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取从自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下被驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株一样也容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变效果可能叠加。另外，还可以同时选取2～3株出发菌株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。

（2）同步培养

在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态相对同步，比较容易变异，重复性较好。具体做法有两类：一类是通过环境条件来诱导同步性，例如变换温度、光线，或向处于稳定期的菌悬液中添加新鲜培养基；另一类是用物理方法将同步生长中的细胞挑选出来，例如将非同步的细菌培养液通过大小不同的微孔过滤器，从而将大小不同的细胞分开，分别取滤液培养，就可获得同步生长的细胞。

（3）制备单细胞或单孢子菌悬液

这一步的关键是制备一定浓度的、分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制。如果是用化学诱变剂处理，因处理时pH会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90%以上，这样可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂，获得较好的诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度为10⁶～10⁷个／mL，放线菌和细菌的浓度大约为10⁸个／mL。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，其中以平板计数法得到的结果较为准确。

（4）诱变处理

首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。常用的物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线（如Co60等）、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖啶类化合物等。

物理诱变剂中最常用的是紫外线。由于紫外线不需要特殊的贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又接近紫色光的射线。紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。紫外线辐射是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，其中的某些电子被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会被激发，不会产生任何化学变化。脱氧核糖核酸能吸收大量紫外线，极容易受紫外线的影响而发生变化，因此紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构的变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交联，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。

化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类。第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基发生化学变化，引发DNA复制时碱基配对的转换而导致变异，例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N－甲基－N′－亚硝基胍等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入DNA分子中而引起变异，例如5－溴尿嘧啶、5－氨基尿嘌呤、2－氨基嘌呤、8－氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少1～2个碱基，从而引起碱基突变点以后的全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一；碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因为其回复突变率高，效果不大。

诱导剂的剂量选择也是一个关键的问题，决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用每毫升几微克至几毫克，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物一般有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后要有合适的终止反应方法，一般采用稀释法、使用解毒剂或改变pH等方法来终止反应。要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、X射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中，而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。

在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。

（5）筛选变异菌株

菌种经诱导处理后，绝大多数是负突变株，筛选的目标是通过尽可能少的工作，将诱导后可能出现的正突变株从大量的突变中分离鉴定出来。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用简化方法，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用培养皿反应直接挑取高产变异菌株等。培养皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。

（6）营养缺陷型突变株的筛选

在诱变育种工作中，营养缺陷型菌株的筛选及应用有着十分重要的意义。营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作为发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。

营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质（如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等）的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野生菌株。凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养基（MM）。在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，形成能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基（CM）。在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，形成能满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基（SM）。

营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。

诱变剂处理时与其他诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型菌株的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗生素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型菌株的目的。抗生素法是利用野生型菌株能在基本培养基中生长，而缺陷型菌株不能生长，于是将诱变处理液在基本培养基中短时培养让野生型菌株生长，使其处于活化阶段，而缺陷型菌株无法生长，仍处于“休眠状态”，这时加入一定量的抗生素，活化状态的野生型菌株就被杀死，保存了缺陷型菌株。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型菌株则不能。因此，将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤，如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型菌株的目的。

营养缺陷型菌株的检出方法很多，主要有影印法、夹层培养法、逐个检出法、限量补充培养法等四种。

影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上，经培养后长出菌落，然后用一小块直径比培养皿稍小的圆柱形木块覆盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的培养皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基平板上，经培养后，比较这两个培养皿长出的菌落。如果发现前一平板上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。

夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标记，然后倒上一薄层完全培养基（或补充培养基），再培养，这时再出现的新菌落多数即为营养缺陷型。此法缺点是结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不容易。

逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布在完全培养基平板上，待长出单个菌落后，用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基平板上。经培养后，如果在完全培养基上长出菌落而在基本培养基上却不长菌落，说明这是一个营养缺陷型菌株。

限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接种在含有微量（0．01%以下）蛋白胨的基本培养基上。野生型菌株会迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。

确定生长谱是指采用上法选出的缺陷型菌株经几次验证确定后，还需确定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，还是维生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生长谱测定可以用两种方法。一种是将缺陷型菌株培养后收集菌体，制备成细胞悬液后，与基本培养基（熔化并冷却至50℃）混合并倾注培养皿，待凝固后，分别在培养皿的5～6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组织营养物的滤纸圆片，培养后会在组合区长出菌落，就可测得所需营养。另一种方法是以不同组合的营养混合物与熔化并冷却至50℃的基本培养基铺成培养皿，然后在这些培养皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据菌株的生长状况推知其营养因子。