腐植酸怎么配制标准溶液

腐植酸医药研究新进展_2011年论文集

周霞萍 张义超 张世万 班卫静 余文凤

（华东理工大学 上海 200237）

摘 要：腐植酸属于生物大分子，自《本草纲目》记载“乌金散”(腐植酸)作为药物应用已有500多年的历史。近30年来，中国数十家医疗单位和大专院校对腐植酸进行了正规的临床试验和毒理学、药理学研究。德国、波兰、瑞士、芬兰等医学家也进行过类似研究，肯定了腐植酸具有活血止血、抗菌、抗病毒、改善微循环、调节内分泌等作用，相当于中草药扶正驱邪、协调阴阳、补偏救弊的功效。作为生物大分子，腐植酸的药理研究虽较薄弱，但仍有迹可循。作为药物，在药典中如何开好处方？这是影响腐植酸医药研究进展的关键问题。作者认为，先采用低碳生物降解法减小腐植酸分子的复杂性，再按腐植酸活性组分、药理药效、确定适用范围，可逐步克服腐植酸医学应用的瓶颈问题，加快腐植酸医药研究的进展。

关键词：腐植酸 生物降解 活性组分 药理药效 处方

New Progress in Medical Research of Humic Acid

Zhou Xiaping, Zhang Yichao, Zhang Shiwan, Ban Weijing, Yu Wenfeng

( East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

Abstract: Humic acids are biological macromolecules. It has been 500 years since “WU-JIN-SAN” (i.e. humic acid) reported in Compendium of Materia Medica. In recent 30 years tens of medical companies and institutions have done regular clinical trials, toxicological and pharmacological research on humic acids. Besides, German, Polish, Swiss, Finland et al. have also done similar research, with the similar efficacy of Chinese herbal medicine like “Streagthening Vital Qi’s Capacity to Resist Pathogens”, “Readjusting Yin and Yang”, “remedy defects and rectify errors” which build a scientific fundament for medical application of humic acid. As biological macromolecules, although humic acid was relatively weak in pharmacological studies, it was still traceable. As a drug, how to make a prescription in the pharmacopoeia? This is the key issues which affect the progress in humic medical research. The author consider: First, the use of low-carbon biodegradation reduces the complexity of humic acid molecules, then acoording to the active component by humic acid, Pharmacological-pharmacodynamic, and determining the scope of medical applications could gradually overcome the bottleneck of medical research in humic acid, accelerat the progress of medical research of humic acid.

Key words: humic acids; biodegradation; active component; pharmacological-pharmacodynamic; prescription

腐植酸富含羧基、酚羟基、醇(酮)基等官能团[1]，属于生物大分子。腐植酸形成的现代理论认为,几乎所有的植物组织和化学组分都参与了腐植酸的形成过程，包括蛋白质(HOOC-RCH2NH2)、叶绿素(C55H72O5N4Mg)、生物碱(喹啉、吲哚等)、脂肪、蜡质、树脂(含松香酸、萜烯等)。天然腐植酸主要存在于年青煤(泥炭、褐煤)中，某些分离提纯后可药用；人工腐植酸取决于原料、腐殖化方法等，形成功能性药源的技术更灵活。

自《本草纲目》记载“乌金散”作为药物应用已有500多年的历史。近30年来，中国数十家医疗单位和大专院校对腐植酸进行了正规的临床试验和毒理学、药理学研究，德国、波兰、瑞士、芬兰等医学家也进行过类似研究，肯定了腐植酸具有活血止血、抗菌、抗病毒、改善微循环、调节内分泌等作用，相当于中草药的扶正驱邪、协调阴阳、补偏救弊的功效。作为生物大分子，腐植酸的药理研究虽较薄弱，仍有迹可循。作为药物，其复杂分子结构，在药典中如何定性、定量，开好处方？作者认为: 先采用低碳生物降解法减小腐植酸分子的复杂性，再依据腐植酸活性组分、药理药效、确定适用范围，可逐步克服腐植酸医学应用的瓶颈问题，加快腐植酸医药研究的进展。

1 低碳生物降解法减小腐植酸分子复杂性的研究进展

腐植酸是复杂的生物大分子，采用低碳生物降解法增加腐植酸活性级分黄腐酸的含量，减小腐植酸分子复杂性，在腐植酸应用中有广泛的意义[2～5]。樊兴明、周霞萍等采用泥炭、褐煤、风化煤腐植酸进行生物降解试验，黄腐酸增加了100%～300%，分子量可以控制在300～500之间。该法在腐植酸医用领域，更能显示以下优势：(1) 选择性生物降解-酶联反应(H+-ATP酶活性)的专一性；(2) 不会带入有害离子或杂质；(3) 可促进药物低碳技术-临床安全应用生物链的良性循环。其工作还有待深入。

2 腐植酸活性组分的研究进展

腐植酸的生物活性组分有多种。其作用可归纳为：(1) 有一定条件下，所含“醌基”[7]氧化还原为“酚基”的周期行为；(2) 多种天然激素(生物/生理活性物质)中，萜类、菑类(雌醇、雌酮等)的主要作用；(3) 维生素复合B、生物素(VB7、VH)，依制备腐植酸的不同原料所做的贡献。

萜类是指具有(C5H8)n通式，由双异戊二烯成倍连结的一类天然化合物。单萜、双萜类化合物广泛存在于高等植物中的分泌组织里，具有较强的香气和生理活性，是医药和化妆品工业的重要原料。萜类化合物具有止血、活血、抗风湿等作用，也具有抗肿瘤作用，涉及多种肿瘤模型，体现在肿瘤发生的多个阶段，包括预防肿瘤的发生、抑制肿瘤的进展、抗肿瘤转移、逆转已生成的肿瘤和化疗增敏作用。其抗肿瘤作用具有一定的选择性，对肿瘤组织的作用要大于正常组织。如萜类β-紫罗兰酮对正常结肠细胞CCD18的IC50值比其对Caco22结肠癌细胞IC50高3倍[8～9]。萜类山茱萸，具有明显的免疫调节,抗氧化,治疗糖尿病,保护神经系统等作用。山茱萸总苷可抑制前列腺素E22(PGE22)的产生，从而抑制PGE22的致炎、致痛作用，并通过抑制脂多糖诱发的环氧合酶(COX22)表达而减少PGE22及NO合成,抑制核转录因子2κB(NF2κB)在细胞核内的水平。意大利研究者Pierluigi Mauri等用LC-MS表征从植物银杏叶抽提的萜类组分，以豚鼠血浆做实验，研究萜类对血小板活化因子（platelet activating factor,PAF）的影响。PAF过高是引起血小板聚集、形成血栓的重要因素。PAF过高也是哮喘、关节炎的主要病因。 Pierluigi Mauri等的实验得出：萜类有抗血小板聚集的作用；也有皮肤抗皱作用。这一成果也适合于人类样本，并可衍生用于烧伤、急性胰腺炎等疾病治疗[10～12]。

甾类是一类以环戊烷全氢菲(甾核)为骨架的天然化合物。Mclean最早发现了泥炭腐植酸含甾类。如碳原子27、28和29的胆甾醇、麦角甾醇和豆甾醇，有很好的抗菌、抗炎、抗病毒作用。甾体还有加强心肌细胞收缩力，参与多种细胞包括肿瘤细胞的肥大、增殖、分化、生存和凋亡等生理、病理过程，能通过多种途径在体内、外发挥抗肿瘤作用。用真菌腐殖化过程来生产所需要甾体，其原料的成本远远低于植物提取[13]。

天然泥炭、褐煤腐植酸中存在着植物次生代谢产物萜类、甾类等生理活性物质[14]，并在植物向泥炭转变过程中得到了富集。新加坡学者[15]的研究显示，纳滤膜可以截止水溶液中的雌酮物；韩国蔚山(Ulsan)大学[16]的工作表明，运用GCMS、HPLC等可以测得腐植酸中的雌酮等成分，但他们的工作是侧重于生态环境处理的。

药妆，在国内还属于较新的名词。继“欧莱雅”“资生堂”等产品进入中国市场后，国内上海家化集团与瑞金医院产学研合作，在“药妆”上研究推出新产品“玉泽”。

生物素VB7或VH是现代护发素的主要功能成分。VB7、VH缺乏，会产生多头屑、脱发、等皮质炎症[17]。在选择好原料的基础上，运用生化腐植酸工艺与化学精制工艺结合，也可以获得生物素VB7或VH。依靠生物素VB7或VH的作用，能起到改善头发营养，逐步长出黑发的最高境界。但将药用腐植酸等天然活性组分用于生化染发，还需要做深入的研究工作，以减少负面影响，增大腐植酸在医疗保健上的贡献。

腐植酸及活性组分中既有亲水性基团(-COO-、-O-等)，也有疏水性基团和部位(芳核、脂肪链、酯基)，具有“类甾醇”药物的疗效，在患者发生炎症的部位，脂溶性的疏水基团能降低其毛细管的通透性，减少血管扩张而引起的浮肿。若仅如此，它会阻碍愈合组织的形成，导致感染并发。而腐植酸还有亲水性基团，它同时与皮肤发生水合反应，增加了皮肤的渗透性，使活性组分易通过表面屏蔽而到达血管真皮。因此，腐植酸同时具有良好的愈伤效果。这虽然尚未见有文献报道，但周霞萍认为，这可以作为开发“腐植酸药妆品”的行业专利。它也可以解释，为什么腐植酸药物能够止血又活血，胜过云南白药；能够消肿、消炎、易愈合，用于风湿病乃至特殊风湿疾病；可以外用于HIV/AIDS等重大疾病晚期的皮肤病变的防治。

在对山西、甘肃、黑龙江的某些腐植酸样品分析中，华东理工大学与合作单位用IR/LC-MS等方法确定了腐植酸及其降解物中存在甾类C27H42O10(胆甾烷)，萜类-吲哚衍生物等多种生理活性组分。可以认为，风靡欧洲的泥炭疗法经久不衰；国内高档疗养胜地，煤炭大省山西运城盐泥疗法等养生理疗中，都有腐植酸活性组分的医疗保健功效。相比腐植酸来源多，结构复杂，不易跨入医学药典的情况，在低碳生物降解等保证腐植酸药用原料的前提下，运用腐植酸活性组分定位法，可逐步解决腐植酸不易进入“药典”门户，不易开处方的瓶颈问题。

3 腐植酸药理药效的研究进展

对上述作为药源的腐植酸，除了在纯度、分子/准分子级别上满足药用原料的质量外，还应加强药理-药效的研究工作。

生物酶属于蛋白质(HOOC-R-CH2NH2)，它是构成植物细胞原生质的基本组分。蛋白质的单体主要是脂族氨基酸，也有少量芳香族氨基酸，如色氨酸、组氨酸等。氨基酸通过肽键(-NHCO-)、硫醚键(-S-S-)、脒键 (-N=C-)，酯键、氢键连接起来。蛋白质有碱性基团(-NH2)和酸性基团(COOH)，是亲水性很强的胶体物质。在需氧条件下，蛋白质可水解成氨基酸、卟啉等氮化物。在厌氧条件下不完全分解，生成不同的多肽，其结构中含有NH、COOH、OH、SH等基团，也是参与HA形成过程的组成部分[1]。HA中的氮、硫及其酶-联反应与蛋白质的含量有关。

MTT是化学名为3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 商品名为噻唑蓝的一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用492 nm波长处测定其吸收值(OD)，可间接反映活细胞数量，从而反映受试药物对淋巴细胞的增值的影响。

樊兴明等利用MTT实验测定腐植酸对HELA细胞(癌细胞)的抑制作用(图1)。即：将对数生长期HELA细胞稀释到2×105个/毫升接种于96孔培养板，每孔接0.1 mL。分别加入不同浓度的腐植酸药物，每浓度平行5孔，空白对照组加等量体积的培养液。置温度35 ℃，5% CO2及饱和湿度的培养箱培养24 h。实验终止前4h取出细胞培养板，先在倒置显微镜下观察，然后在每孔中补充MTT工作液20 μL，终浓度0.5 g/L。培养结束后，采用离心2000 rpm×10 min，用微量加样器小心地吸弃上清，再加入100 μlDMSO，振荡10 min。待MTT还原产物完全溶解，在酶标仪上以492 nm为检测波长，630 nm为参考波长测定光密度值(OD值)。计算细胞的存活率，并以药物的不同浓度和细胞的存活率作图。

细胞存活率＝[试验组OD平均值]/[空白对照组OD平均值]×100%

半数抑制浓度(IC50)：引起半数细胞死亡的药物浓度。

图1中腐植酸MTT实验结果显示，其对HELA细胞的存活率为72.35%时，浓度为500 μg/mL，其抑制活性明显优于文献。而从图2Wei-Jiunn Lee等[18]的结果可以看出，加长腐植酸药物的作用时间，从24 h延长到48 h，也会大大提高腐植酸对癌细胞的抑制活性。

图1 不同腐植酸活性组分对HELA细胞的抑制效果
Fig.1 Inhibition effect of different active components by humic acid on HELA cells

图2 腐植酸对细胞存活率的影响
Fig.2 Effect of humic acid on cells viability

上图2的实验方法是：将细胞置于不同浓度的腐植酸中48h，并利用MTT法测定细胞的存活率。相对于未经处理的控制细胞，可以得出细胞存活率的值。在显著性检验因子p<0.05条件下对比添加腐植酸的控制细胞存活率；同时，在显著性检验因子p<0.05的条件下，对比不加腐植酸与加腐植酸的细胞存活情况进行比较[19～20], 得出的规律如图2所示.可以看出,在同样的500μg/mL浓度下, 对HELA细胞的存活率高于图1。

腐植酸及活性组分的药理作用情况如下。

(1) 腐植酸类有机酸杀菌作用取决于未电离的分子，它透过细菌的细胞膜对细菌起杀灭作用。

(2) 腐植酸有花生四烯酸(C20四烯酸)的抗菌、消炎等作用。

(3) 腐植酸中的萜类，通过微生物细胞膜，干扰了能量代谢的酶促反应，影响其能量代谢途径来达到抗菌效果。

(4) 腐植酸中脂溶性的甾类，容易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，引起细胞凋亡或死亡,影响免疫系统。

(5) 生化腐植酸的醇、酚羟基数目较多，在清除脂质过氧化产生自由基的同时，抑菌作用有所增强，半衰期约1小时,＜0.1 g,符合一级动力学。

(6) 腐植酸中的酚羟基可与蛋白质分子中的氨基或羧基结合，其疏水的苯环结构也可与蛋白质发生疏水结合，腐植酸与蛋白质之间的多点结合作用，阻止了细菌的侵染，使其具有抑菌性。

4 腐植酸适用范围与药典标准的研究进展

前已述及，腐植酸作为药物，历史悠久。涉及的临床疾病达30多种。除了日本、德国、国内佛山市天宝日化保健品厂等在润湿、抗紫外线侵蚀、浴液、护肤、防晒、防斑、抑制粉刺方面，有自己的几种化妆品品种在延续生产、少数的保健药在临床应用外，其他参与重大疾病、特殊疾病的腐植酸药物生产几乎没有。原因之一，没有列入药典，不能名正其顺地制造。

据欧洲药典质量标准起草及标准物质制备机构介绍，作为欧洲34个成员国执行的标准,要求所有在欧洲销售的原料药、植物药和药物制剂中使用的原料药及辅料，都包括在其中，并通过EDQM的CEP认证。目前，欧洲药典可提供1800多个标准物质，全球有50多个国家使用欧洲药典标准物质。2006年3月正式生效的欧洲药典，就标准物质的定义、分类、制备、标化程序、定值以及标准物质的包装等都一一作了规定。

今天，既然将腐植酸定位在中药体系，则应按中药药典的标准，衡量产品研究是否到位，文献[21]概述了2010年第5版，中国药典，中成药药典的新标准[22]，文章指出:国家根据中药具有多组分、多靶点、相互协同作用的特点, 加强了多药味、多成分检测；逐步由单一指标性成分定性定量向活性、有效成分检测过渡，向多成分测定及整体质量控制模式转化，标准更加科学有效；加强了有害物质、有毒成分的检测，药品安全性得到进一步保障；采用了HPLC、薄层色谱等指纹图谱和特征图谱检测技术，控制中药整体质量的方法也能引申到根据腐植酸的萜类、甾类等生理活性组分，按药理-药效配制处方，研制成合适的外用药、内服药的生产上来。通过进一步规范处方、制法的绿色环保,临床应用，根据国家中药药典新规定，建立国家级、部颁级的检测标准；通过申请商标等，正规申请新药的手续，可逐步生产符合药典的腐植酸系列新产品。

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