成纤维细胞的基本研究方法

Fb的基本研究方法大致分为组织原位研究和体外培养两大类。毫无疑问，组织原位的研究能如实反映组织中生理或病理条件下Fb功能或活性的实际情况，但也存在着研究手段有限，难以进行动态和深入研究的局限性。而在细胞培养的基础上，就可以运用多种技术和方法对Fb生物学特性的多个层面、动态过程进行系统和深入的研究，对揭示Fb的功能和特性大有裨益。人类对真皮Fb生物学特性的认识在很大程度是建立在细胞培养研究基础上的。然而，细胞培养研究不是万能的、绝对的，也同样存在着诸多影响因素，应注意以下一些方面：①由于Fb存在异质性，应考虑到取材部位的一致或对应。②标本取材应考虑到临床上不同病期Fb功能或特性的差异。③离体培养后，Fb由于失去活体中某些活化因素的作用，其表型特征将可能随反复传代培养而丢失，故培养细胞应在较早期的传代次数时进行研究。④应注意培养基中添加成分（如血清）对细胞活性或功能的潜在影响。总之，应正确并适当地运用有关研究手段。

一、组织原位的研究

在组织原位可观察Fb的分布、排列、结构特点和某些分子的表达等情况，能反映组织中Fb功能或活性的实际情况。组织原位的研究主要运用以下技术方法：①光镜及电镜观察。主要用于研究组织和细胞的结构特点。②免疫荧光及免疫组化方法。观察细胞骨架蛋白、细胞外基质成分、细胞因子及受体、黏附分子及其他分子的表达。除免疫荧光法外，生物素－抗生物素复合物法（ABC法）和过氧化物酶标记的链霉卵白素法（SP法）是较常用的免疫组化方法。③原位分子杂交。观察Fb某些基因的表达情况，如胶原或某些细胞因子mRNA的表达。

二、体外培养成纤维细胞的研究

组织和细胞培养技术的发展为深入、系统、动态地研究Fb的生物学特性奠定了基础，Fb培养已被广泛应用于细胞生物学的研究。培养Fb常用加有10%胎牛血清的DMEM培养基、MEM培养基和RPMI 1640培养基，还有人用F10或F12培养基。由于培养液所含血清（内含多种因子）也可能影响Fb生物学特性，已有人使用无血清培养液进行Fb培养。通常使用传代培养的Fb进行研究。鉴于一些学者对培养的传代细胞使用“细胞株（cell strain）”或“细胞系（cell line）”的称谓并不一致，根据组织培养协会命名委员会Schaeffer的“动物组织培养名词的建议用法”，将传代培养的Fb称为“细胞系”为宜。

（一）成纤维细胞培养

1．成纤维细胞的原代培养 在无菌条件下，用D－Hanks溶液将新鲜皮肤标本的血污充分漂洗干净，分别去除皮下组织和表皮，然后，便可从真皮结缔组织中分离培养Fb。从真皮结缔组织中初始分离培养Fb的方法有两种：①组织块法（explant culture）。将真皮组织剪切成0．5～1mm3的组织块。将小组织块均匀摊布于培养瓶底，组织块间距约为0．5cm。将培养瓶翻转至底面向上，加入适量培养液，在37℃、5%CO2的饱和湿度条件下孵育2～3h后，缓缓翻转培养瓶，使培养液柔缓地浸没组织块。在上述条件下继续培养，每周更换培养液2次，数天后便可见从小组织块中迁移出的Fb，这些细胞会进一步分裂和增殖。②胶原酶消化法。将真皮组织剪切成0．5～1mm3的组织块，在37℃、每分钟100转的速率缓慢旋转振荡，用细胞培养液配制胶原酶溶液（0．5mg／ml）用以消化已剪碎的真皮组织30～60min，用细胞筛网过滤后，收集滤过液并在每分钟1 500转下离心，将离心得到的沉淀物（含有Fb）用细胞培养液漂洗、重悬后，接种于培养瓶中并置于37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养。

2．成纤维细胞的传代培养 待原代培养中生长的Fb接近或达到融合时，用0．25%胰蛋白酶消化细胞，便可进行传代培养。传代培养的Fb常采用单层培养（monolayer culture），即Fb锚着于培养器皿表面呈单层生长的方式。传代培养的Fb在某些研究中也可采用三维培养（three－dimentional culture）的方式，即Fb被置于胶原凝胶、纤维蛋白凝胶、明胶凝胶、含有多种基质成分的复合凝胶（如复合壳多糖凝胶）中进行培养。三维培养体系能较好地模拟Fb在组织中的立体生存环境，其中的Fb可引起凝胶基质的收缩，某些因素可影响Fb对凝胶的收缩力。

（二）成纤维细胞黏附试验

黏附试验在一定程度上可反映Fb的基质受体或黏附分子表达，用于观察Fb与其他类型细胞的黏附或Fb与基质的黏附：①细胞－细胞黏附试验。在单层培养的Fb上加入定量的淋巴细胞并作用一定时间，漂洗后观察黏附于成纤维细胞单层上的淋巴细胞数量。②细胞－基质黏附试验。将不同的细胞外基质成分包被培养板，加入定量的Fb并作用一定时间，漂洗后观察黏附的细胞数量。

（三）成纤维细胞趋化试验

利用Boyden培养小室进行。①趋化分析（chemotaxis assay）。Boyden小室用聚碳酸微孔滤膜分隔，将具有或可能具有趋化活性的物质加入下部，Fb悬液置于上部，通过测量滤膜下面穿过细胞数的多少来评价趋化反应。②侵袭分析（invasion assay）。基本方法同趋化分析，只是用胶原（或其他基质成分）包被滤膜，观察穿过包被有基质滤膜的Fb数量。这是考虑到Fb在组织中迁移时必须穿过细胞外基质的实际情况而改良设计的。

（四）成纤维细胞增殖活性分析

对成纤维细胞增殖活性的分析主要包括：①生长曲线和丝裂指数测定。②DNA合成测定，常采用3 H－TdR掺入法进行。③活细胞染色及计数，采用四甲基偶氮唑（MTT）法进行。④细胞周期分析，可用流式细胞仪测定。

（五）成纤维细胞的细胞外基质合成或降解的检测

检测Fb的细胞外基质合成主要包括：①检测胶原合成。普遍采用3 H－脯氨酸掺入法，也有人采用ELISA法检测胶原合成。②检测纤维粘连蛋白合成。通常采用35S－甲硫氨酸掺入、免疫沉淀和SDS－PAGE法进行，但也有人使用ELISA法。③检测糖胺聚糖合成。采用35S－硫酸钠掺入法检测糖胺聚糖总的合成情况。采用3 H－氨基葡萄糖和35 SO2－4掺入细胞、酶消化分离不同组分标记物、DEAE－纤维素或Sepharose CL4B柱层析和醋酸纤维素电泳，可分析不同种类含硫糖胺聚糖的合成情况。

检测Fb细胞外基质的降解，通常进行基质金属蛋白酶活性的检测，尤以Fb胶原酶活性分析较为常用。收集Fb培养液上清，采用SDS－聚丙烯酰胺凝胶加Ⅰ型胶原底物电泳测定胶原酶活性。

（六）单层培养或三维培养中成纤维细胞形态、结构及细胞动力学的图像分析

除了运用普通光学显微镜、倒置光学显微镜、荧光显微镜和电子显微镜对单层培养或三维培养的Fb进行形态、结构或某些分子表达情况进行分析外，激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy）是近10余年来发展起来的一项新的图像分析仪器，其性能对光学显微镜而言意味着质的飞跃，对电子显微镜而言是有力的补充，已用于细胞生物学研究领域，可进行荧光定量测定、共聚焦图像分析、三维图像重建、细胞间通讯分析、活细胞动力学参数监测、细胞膜流动性测定、黏附细胞分选、细胞显微激光外科（如细胞膜的瞬间穿孔、某些细胞器的切除）等多项研究。

（七）单层培养或三维培养成纤维细胞的免疫细胞化学染色和原位分子杂交

与组织原位中的研究相类似，也可运用免疫细胞化学染色和原位分子杂交技术来检测单层培养或三维培养的Fb中某些分子的表达情况。

（八）分子生物学技术的应用

以培养的Fb为研究对象，可运用斑点印迹、Southern印迹、Northern印迹、核酸酶保护分析（RNase protection assay）、多聚酶链式反应（PCR）、反转录（RT）－PCR、Western印迹、DNA或蛋白芯片技术等多种分子生物学手段，分析Fb的某些基因表达情况。

（九）其他

利用放射免疫分析法、酶联免疫吸附法或其他生物化学方法检测培养Fb中某些分子的表达或某些因子的分泌情况等。