常见植物成分的定量测定方法

常见植物成分的定量测定方法_中国灭鼠植物及其

三、常见植物成分的定量测定方法

（一）皂苷及其苷元

皂苷广泛存在于自然界，在单子叶或双子叶植物均有分布。根据其化学结构分为三萜皂苷和甾体皂苷两大类。三萜皂苷在豆科、五加科、桔梗科、伞形科、远志科、报春花科、葫芦科、菊科等科的植物中普遍存在，甾体皂苷常见于百合科、薯蓣科、茄科、菝葜科。关于皂苷的研究已有近百年历史，但由于皂苷相对分子质量大，极性大，难于分离，具有溶血性和毒性等原因，因此过去的研究进展比较缓慢。近20年来，随着分离方法和化学结构测定方面新技术的应用，皂苷的研究有突破性的进展。很多重要的中草药如人参、三七、绞股蓝、柴胡、甘草、黄芪、远志、商陆、桔梗、知母等得到了系统的研究，各种皂苷的生物活性和药用价值也逐渐地被认识。早期较粗糙的定量方法有：泡沫指数法、溶血指数法、皂苷指数法、质量法、红外光谱法、液滴逆流层析法、棒状薄层扫描法、库仑滴定法、极谱法、电位滴定法等。

目前常用于皂苷定量的方法有：

1.比色法

由于化学颜色反应比较灵敏，简便易行，因此在皂苷成分的测定中比色法仍占有较为重要的地位。但通常专属性较差，如浓硫酸、高氯酸、硫酸—醋酐等显色剂可与许多皂苷元生成颜色，干扰测定。一般常用显色剂如下：

①浓硫酸：与许多甾体皂苷元反应后的产物，在紫外或可见光区有吸收。甾体皂苷可与硫酸反应成黄色，但需在较高的温度（80～90℃）反应30～60min显色，而且硫酸的浓度、反应温度、显色时间等的改变都将影响吸收度。另外样品中的植物残渣、树脂，特别是糖或其他糖苷的存在都会影响测定结果。

②高氯酸：因△5，6不饱和结构与高氯酸在室温下即可生成黄色产物，所以薯蓣皂苷盛元可用此法测定而其他皂苷元无干扰（绿莲皂苷元除外）。菝葜中总皂苷加高氯酸后，于70℃水浴加热15min后生成的黄色产物在405～409nm处有最大吸收，颜色在30min内稳定（干国平等，2008）。

③香草醛—硫酸或高氯酸：一般以5%香草醛—硫酸、高氯酸，60℃放置15min后在544nm处测定吸收度。此试剂常用于人参皂苷、甘草酸、柴胡皂苷元、常春藤皂苷元、齐墩果酸、替告皂苷元和海柯皂苷元的测定。如陆蕴如等以香草醛—硫酸为显色剂，在544nm处测定了饮片甘草及蜜炙甘草中甘草酸的含量（陆蕴如等，1981）。也有用香草醛—硫酸在60℃处理10min后在454nm测定吸收度，此试剂被用于人参皂苷、甘草酸、商陆皂苷、皂荚皂苷的含量测定。如陈道峰等用比色法测定了皂荚皂苷的含量（陈道峰等，1995）。

袁丁等（2008）采用此法测定了中药竹节参中总皂苷的含量，具体方法：

样品溶液的制备：取竹节参药材粉末1.0g，置索氏提取器中用乙醚回流1h，弃去乙醚液，药渣挥去乙醚用甲醇200mL加热提取，提取液挥干，残渣以转移至分液漏斗中，用水饱和正丁醇提取，正丁醇提取液蒸后加甲醇溶解并转移至25mL量瓶中定容即得。

对照品溶液的制备：称取人参皂苷Re对照品适量，置10mL量瓶中以甲醇制成每1mL含1.30mg的对照品溶液，即得。

最大吸收波长的确定：精密吸取人参皂苷Re对照品溶液50μL和竹节参样品溶液40μL，分别置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，分别精密加入新配制的5%香草醛－冰乙酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，加塞，摇匀，于60℃水浴加热15min，取出置冰水浴中冷却3min；分别精密加入冰醋酸5mL，摇匀，于可见波长段带（400～700nm）扫描。结果表明，人参皂苷Re对照品溶液和竹节参样品溶液经香草醛－高氯酸试剂显色后的吸收光谱基本一致，均在552nm处有最大吸收波长。

标准曲线的制备：分别精密吸取人参皂苷Re对照品溶液30、50、70、90、110和130μL，置于10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，同最大吸收波长的确定项下方法操作，随行试剂作空白，于552nm处测定吸光度。以吸光度（A）对人参皂苷Re质量浓度C（mg·L－1）进行线性回归，得回归方程：A＝0.0194C－0.0059，r＝0.9998，该结果表明人参皂苷Re在6.50～28.17mg·L－1质量浓度范围内线性关系良好。

样品的含量测定：取不同产地的竹节参药材粉末1.0g，称定后分别按照以上项下各方法操作，于552nm处测定吸光度。由标准曲线给出样品溶液相当于人参皂苷Re对照品溶液的质量浓度，根据回归方程，计算样品中总皂苷的含量。

④其他试剂：亚甲蓝与甘草酸形成的结合物可在640nm比色，甲醛—硫酸试剂可与具有△5结构的皂苷或苷元生成紫色进行测定。此外，还有硫酸—醋酐，硫酸—冰醋酸等显色剂。

2.紫外分光光度法

甘草酸一般在252nm有吸收峰，而在NaOH溶液中峰的位置在258nm。远志皂苷50%甲醇溶液在309nm有最大吸收。△9－海柯皂苷元由于C－9、C－11的双键形成共轭在238nm处有最大吸收。由此，可直接在紫外区内用分光光度法测定，如毛丽珍等采用紫外分光光度法在252nm处测定了八珍颗粒剂中甘草酸的含量（毛丽珍等，1992）。

3.薄层扫描法

在测定某单一成分时，若无特异测定方法，为了消除杂质或其他皂苷元的干扰，常用薄层层析法使被测成分与其他成分分离开，然后不经洗脱，直接在薄层上测定其吸收度或斑点面积。到目前为止，此方法在皂苷或苷元测定中用得很多。

4.气相色谱法

此法已用于海柯皂苷元、薯蓣皂苷元、菝契皂苷元、雅姆皂苷元、替告皂苷元、派诺皂苷元等的测定。测定甘草酸，可先水解为甘草次酸并酯化形成衍生物后再用气相色谱法测定（杜志德等，1991）。人参皂苷先用N-三甲基硅咪唑进行三甲基硅醚化后再用气相色谱法进行含量测定。

5.高效液相色谱法

此法已用于海柯皂苷元、△9－海柯皂苷元、薯蓣皂苷元、替告皂苷元、△9－替告皂苷元、齐墩果酸、人参皂苷、柴胡皂苷等的测定（谭仁祥，2004）。常用示差折光检测器（RI）或紫外检测器，紫外检测多用低波长。由于示差折光检测器对流动相成分、温度、流速变化比较敏感，基线不易走稳，而紫外低波长检测对试剂的要求比较高，而且柱子分离效果较差，所以迄今高效液相色谱法还只是用于一部分单体皂苷的分析，其他皂苷的分析有待进一步探索。近年来兴起的蒸发光散射检测器解决了各类检测难题。与低波长UV相比，它使流动相的组分有更广阔的选择余地；与示差检测器相比，它有三大优点：与梯度洗脱相容，无溶剂前沿峰的干扰，基经稳定。因此，蒸发光散射检测器迅速地被皂苷研究者所采用（李会军等.2000）。

例：袁丁等（2008）采用此法测定中药竹节参中齐墩果酸的含量

色谱条件：色谱柱为YMC-packODS-AQ柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－水－冰醋酸－三乙胺（90∶10∶0.04∶0.02）；检测波长为210nm；流速为1.0mL·min－1；柱温为30℃。在此色谱条件下，竹节参样品溶液中齐墩果酸与其他组分能达到基线分离。

标准曲线的制备：精密称取齐墩果酸对照品适量，置10mL量瓶中，以甲醇制成每1mL含1.18mg的对照品溶液。分别精密吸取该对照品溶液4、6、8、10、15和20μL，按选定的色谱条件进样测定。以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程：Y＝444293.609X＋17052.413，r＝0.9999，线性范围为4.72～23.60μg。

样品溶液的制备及测定：取竹节参药材粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中加入甲醇50mL，称定质量，超声处理（功率250W，频率50kHz）40min，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液10mL，回收溶剂至干，残渣加25%盐酸20mL、三氯甲烷25mL，加热水解1.0h；水解物用三氯甲烷振摇提取2次，每次25mL，合并提取液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。按照标准曲线中的方法进行测定。

（二）生物碱类

生物碱的定量方法大多是根据它含有的N原子或双键或其他官能团的理化性质而设计的。如测定总碱的方法有：质量法、容量法、比色法、紫外分光光度法等。质量法是根据游离生物碱和生物碱盐在水和有机溶剂中溶解度的不同而设计的，也可利用与沉淀试剂发生反应形成不溶性盐来进行设计。容量法则是利用其碱性在水介质中进行的中和滴定。比色法是测定总碱含量最重要的方法之一，它是根据生物碱的颜色、官能团与特定试剂（盐酸羟胺、硫氰酸铬铵等）发生反应产生的颜色，或生物碱与酸性染料（溴甲酚绿、香草酚蓝等）在一定条件下所成复合物的颜色等，在特定波长测定吸光度来完成总碱含量测定的。另外大多数生物碱分子结构中含有双键，在紫外区有吸收，因此，也可用紫外分光光度法于特定波长处测定吸收系数相近的总碱含量。以上均属测定总碱的好方法，但测定指定成分的含量，就需用高效液相色谱法及薄层扫描法（王强，1996）。

以下举例说明生物碱含量测定中的几种主要方法。

1.高效液相色谱法

虽然生物碱的离子化性质使其能满足离子交换的条件，但离子交换HPLC在生物碱分析方面的应用却不多，生物碱的HPLC分析方法主要有反相、正相法。其中反相色谱在生物碱的HPLC分析方面应用最广，所用流动相通常由水和甲醇（或乙腈）组成。最常使用的检测方法是UV检测。

植物中的生物碱成分，通常用一般方法很难分离和定量；样品必须经过预处理方可得到满意的结果。

（1）通过预柱处理：植物提取物先通过预柱，将某些成分分离后，再导人特定的固定相，以流动相洗脱，达到分离、测定的目的。文献中常用Sep－pak中性氧化铝预柱先将植物提取物分级分离。

（2）吸附和离子对色谱法：黄柏和黄连中小檗碱，以无定形硅胶为固定相，乙酸乙酯：甲醇：无水乙醇＝15∶3∶2为流动相进行测定。反相离子对色谱法在生物碱含量测定中应用较多，如贝母类药材中贝母辛的含量，以甲醇－水（69∶31），内含7.5mmol／LSDS为流动相，用ODS柱在280nm处进行测定（晁若冰等，1993）。洋金花中东莨菪碱的含量测定也运用了反相离子对色谱法（于霖江等，1992）。

（3）应用不同的检测器：高效液相色谱法测定生物碱含量大多采用紫外检测器，检测波长常为254或280nm。有荧光的生物碱可用荧光检测器，如麦角生物碱。朱丹妮等最近还采用新兴起的蒸发光散射检测器，在Silica5μm（250mm×4.6mm）色谱柱上，以环己烷—乙酸乙酯—二乙胺（6∶4∶1）为流动相测定了贝母类药材中生物碱的含量（朱丹妮等，2000）。

2.酸碱滴定法

例：杀鼠植物4种秦岭产乌头［甘青乌头A.tanguticum（Maxim.）Stapf、铁棒锤A.pendulumBusch.、太白乌头A.taipaicumHand.Mzt.和松潘乌头A.sungpanenseHand.Mazz］块根中的毒性成分—生物碱的含量测定（杨长花等，2008）

分别取块根粉末适量，精密称定，置碘量瓶中，加氨试液润湿，再加乙醚50mL，密塞摇匀，放置过夜；滤过，药渣加乙醚50mL，连续振摇1h；滤过；药渣再用乙醚洗涤3～4次；每次15mL，滤过；洗液与滤液合并，低温蒸干，残渣加乙醚－三氯甲烷（3∶1）的混合液5mL使溶解并蒸干；再加乙醇5mL使溶解，精密加入硫酸滴定液（0.01mol·L－1）15mL、水15mL与甲基红指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.02moL·L－1）滴定至黄色。每1mL硫酸滴定液（0.01moL·L－1）相当于12.9mg的乌头碱，计算出总生物碱的含量。

3.分光光度法

例：杀鼠植物博落回中毒性成分生物碱的含量测定（徐建泓等，2008）

标准曲线制备：精密称取标准品99.9%血根碱盐酸盐10mg置100mL容量瓶中，加少量重蒸馏水，使其完全溶解，再用重蒸馏水加至刻度。准确吸取上述溶液0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mL，分别置于5个10mL容量瓶中，用重蒸馏水稀释至刻度，摇匀，静置10 min后，应用紫外分光光度法，以重蒸馏水作空白对照，在284nm波长处测其吸收度。按最小二乘法，以吸收光度值为纵坐标，以对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程Y＝0.0327X－0.0162，r＝0.9992。博落回生物碱的血根碱浓度在5.00～100.00μg·mL－1，有良好的线性关系。

样品提取：博落回果实在粉碎机中粉碎，过0.8mmTSD检验筛，得博落回果实粉，分别称取20.00g置索氏提取器回流提取，合并提取液，水沉，过滤，旋转蒸发回收溶剂，水浴蒸干，80℃干燥3h，干燥器中冷0.5h即得。

生物碱含量测定：精密称取干燥恒重的样品浸膏1mg于10mL容量瓶中，加少许重蒸馏水，稀释至刻度，再取此溶液1.0mL于10mL容量瓶中，重蒸馏水稀释至刻度，得到博落回生物碱样品液，按标准曲线制备项下处理并测定。

4.薄层色谱法

薄层色谱法作为植物中化学成分的鉴别方法，已有30多年的历史，这一较为古老的色谱技术由于可以提供彩色图像、形象直观，具有其他色谱技术所不能的特点而被广泛使用。用于灭鼠植物中化学成分的特征图谱分析，它的这一优势更能得到充分发挥。

薄层色谱法根据展开后测定的情况，又可分为薄层色谱—分光光度法和薄层扫描法。

（1）薄层色谱—分光光度法：样品经薄层层析展开后，刮取与对照品斑点相应位置上的供试品条斑，用适当溶剂洗脱，收集洗脱液，采用分光光度法定量。本法分离速度快、效率高，适于微量成分的分离和测定，按分离后的检测方法又可分为比色法、紫外分光光度法和荧光法。

（2）薄层扫描法：在薄层色谱板上，通过薄层扫描仪直接测定有效成分的光吸收度或荧光强度，计算出待测成分的含量。此法较薄层层析—分光光度法简便、灵敏、稳定性好。据扫描波长范围又可分为比色法、紫外分光光度法和荧光法。

例：杀鼠植物钩藤中毒性成分生物碱类成分的薄层色谱分析（唐勇琛等，2007）

供试品溶液的制备：取钩藤对照药材粉末3.0g，用0.1mol·L－1浓氨试液浸润（2h以上），用30mL氯仿超声提取40min，过滤，滤液水浴挥干，残渣用3.6%HCl超声溶解，过滤，滤液用浓氨水调pH9～10，用氯仿萃取3次，每次5mL，氯仿水浴挥干，残渣用2mL氯仿溶解，作为供试品溶液。

薄层色谱试验条件：硅胶G薄层板（100mm×100mm；100mm×200mm），点状点样，点样量10μL。展开剂为氯仿－丙酮－氨水（50∶20∶0.3），展开，晾干后，喷以稀碘化铋钾溶液至斑点显橙红色，加同样大小玻璃板密封。反射法双波长锯齿形扫描，λS＝520nm，λR＝650nm，狭缝0.4mm×0.4mm。

（三）黄酮类

文献报道的常用于黄酮类化合物含量测定的方法有比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法等。

1.比色法

常利用黄酮类化合物结构上的酚羟基特征及其还原性进行显色，有邻二羟基或3、5位有羟基取代的黄酮可与金属离子形成黄色或橙色的络合物，这些络合物在特定波长有最大吸收，可由此用比色法进行定量。最常用的显色剂为硝酸铝—亚硝酸钠溶液，能与冀酮类化合物生成铝络合物，在510nm处有最大吸收，如庄向平等用甲醇于索氏提取器中回流8h提取银可叶中的总黄酮后，以硝酸铝—亚硝酸钠显色，于510nm处用分光光度计测定了总黄酮的含量（庄向平等，1992）。赵慧庆等也用此法测定了槐角丸中总黄酮的含量（赵慧庆等，1992）。

某些酚类试剂也与黄酮类化合物呈色，例如Folin试剂与葛根素、芦丁等显蓝色，对氨基苯磺酸、对氨基苯甲酸也与芦丁产生颜色，适宜比色。

2.紫外分光光度法

黄酮类化合物均含有a-苯基色原酮基本结构，羰基与2个芳香环形成两个较强的共轭系统，对紫外光相应有两个区域特征吸收，最大吸收波长范围随各化合物不同而异。可利用最大吸收波长直接用紫外分光光度法定量测定植物中黄酮类化合物的含量，如赵春香等先用大孔树脂D-101分离，后在270nm处测定了骨质增生止痛液中淫羊藿苷的含量（赵春香等，1996）；陈芳群等在266nm处测定了射干、川射干、白射干中总黄酮的含量（陈芳群等，1991）；李星海等先用聚酰胺薄膜为固定相，正丁醇—乙酸—水（4∶1∶5）上层液为展开剂分离后在257nm处测定了秦岭金丝桃属三种植物药中金丝桃苷的含量（李星海等，1994）。

3.薄层扫描法

利用黄酮类化合物在紫外区的吸收特征，在薄层板上直接用薄层扫描仪取得薄层斑点的面积积分值，由回归方程计算含量。

4.高效液相色谱法（HPLC）

该方法很适合分离成分复杂的植物样品。因薄层分离度所限而不能测定的一些黄酮成分，用该法都能得到满意的结果，如2000年版药典中黄酮类成分的定量大多采用该法。

近年来，HPLC法尤其是RP-HPLC法在黄酮类化合物定量分析中得到了广泛的应用，如Hasler等采用HypersilODS为固定相，MeOH－0.5%H3PO4为流动相梯度洗脱，桑色素为内标，分离并测定了银杏叶提取物中5种黄酮苷元含量（HaslerAetal，1990）；Pi-ettaPG等用Nucleosil100ODS为固定相，0.5%H3PO4－MeOH－THF为流动相梯度洗脱，测定了银杏叶黄酮类化合物含量（PiettaPGetal，1991）。

除此之外，2000年版药典中还有不少药材中黄酮类化合物的定量采用此法（国家药典委员会，2000），如骨碎补中柚皮苷的含量测定：甲醇－醋酸－水（35∶4∶65）为流动相，检测波长为283nm；侧柏叶中槲皮苷的含量测定：0.01mol／L磷酸二氢钾溶液－甲醇－冰醋酚（60∶40∶1.5）为流动相，检测波长为254nm；青皮中橙皮苷的含量测定：甲醇－水（25∶75）为流动相，检测波长为284nm；陈皮中橙皮苷的含量测定：甲醇—醋酸—水（35∶4∶61）为流动漠相，检测波长为283nm。

有关高效液相色谱法在黄酮类化合物中的应用已有综述（郑玉果等，1994）。

（四）蒽醌类化合物

蒽醌类化合物都具有多方面的生物活性，重要的是致泻和抗菌作用。常用的含蒽醌灞类的中药，首推大黄，其次为芦荟、鼠李、决明、茜草、虎杖、何首乌、水蓼、番泻叶。测定这些中药中蒽醌类含量常用的方法是分光光度法，其次为薄层扫描法和高效液相色谱法。

1.分光光度法

依据蒽醌类成分与碱溶液反应生成红色，于500～550nm处有最大吸收来比色定量，还原型蒽醌需变成氧化型蒽醌。常用显色剂为5%氢氧化钠－2%氢氧化铵（1∶1）混合溶液和醋酸镁甲醇液。

贾元印等采用5%氢氧化钠－2%氢氧化铵显色，在510nm处测定了石斛夜光丸中蒽醌类成分的含量（贾元印等，1998）。

应用比色法测定蒽醌类成分，重要环节在于蒽醌衍生物的提取及显色，文献中常用硫酸－有机溶剂提取法，提取溶剂以氯仿最好。5%氢氧化钠－2%氢氧化铵溶液显色稳定性较差，要求最好在30min内完成比色，所以也有文献用醋酸镁甲醇液显色法，该法反应灵敏，干扰少，且不必避光，如韩晋等以醋酸镁甲醇液为显色剂，采用差示分光光度法510nm处测定了复方虎杖丸中蒽醌的含量（韩晋等，1997）。

2.薄层扫描法

利用蒽醌类在紫外灯下大多有荧光的特征，可在薄层板上直接用薄层扫描仪扫描定量。

3.高效液相色谱法

虽然中药中蒽醌类成分的定量方法很多，但都显得烦琐、费时，尤其是样品的制备与分离过程更是复杂费时。TLC虽能分离得单一成分，但分离度欠佳，实际色谱过程需要展开数次才能测定，而HPLC法则克服了上述缺点，分离结果也令人满意。

（五）香豆素类

香豆素类多分布在伞形科、豆科、茄科、菊科及芸香科植物中，具有多方面的生物活性，如前胡、补骨脂等中的香豆素类对实验动物有一定的抗癌作用；蛇床子中的蛇床子素治疗脚癣、湿疹和阴道滴虫等病；羟基香豆素类（伞形香豆素、佛手内酯、补骨脂素等）还有吸收紫外线和抗辐射的作用。目前，香豆素的定量方法主要有薄层色谱法、分光光度法和气相色谱法。2000年版药典主要采用薄层扫描法。

1.薄层扫描法

香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光，因此，样品经薄层色谱法分离后可直接在薄层板上用薄层扫描仪进行荧光扫描测定吸收度。

李宏宇等采用在硅胶G薄层板上点样，石油醚－乙醚（5∶3）上行展开，λS＝300nm，λR＝400nm范围内测定了白芷中3种香豆素（欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素）的含量（李宏宇等，1991）。

2.分光光度法

香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光，因此可用荧光分光光度法测定。另外，香豆素类化合物羟基和芳环形成的共轭体系具较强的紫外特征吸收，最大吸收峰在315±8nm，据此又可用紫外分光光度法测定。黄劲梅采用乙醚索氏低温回流提取香豆素，在分光光度计上于273nm处测定了消脱痔及零陵香浸膏中香豆素的含量（黄劲梅，1997）。

3.气相色谱法

游离香豆素化合物多具芳香气味，能随水蒸气挥发或升华，因此也常用气相色谱法来定量，或先经柱前衍生化后再用气相色谱法定量。

高海等还用毛细管气相色谱法测定了蛇床子中蛇床子素和欧前胡素的含量（高海等，1991）。蔡金娜等也用毛细管气相色谱法对7种不同产地的蛇床子和25种商品药材中8种香豆素类成分进行了测定（蔡金娜等，1991）。

另外，高效液相色谱法也逐渐被用来测定香豆素的含量（王天志等，1995）。

（六）强心苷

强心苷成分是一类对心肌有兴奋作用，具有较强心生理活性的甾体化合物，主要分布于玄参科、夹竹桃科、百合科、萝摩科、十字花科、桑科、卫矛科等植物中。常用的定量方法有比色法和高效液相色谱法，其他的还有薄层扫描法、紫外分光光度法和极谱法等。

1.比色法

主要是利用其α，β－不饱和内酯结构和α-去氧糖经适当反应后显色，通过分光光度计比色来定量。

（1）基于a，β-不饱和五元内酯的作用：苷元C－17上的丁烯内酯部分非常活泼，容易和芳香的硝基化合物形成有色加成物。据此原理，常将其与碱性苦味酸试剂（1%苦味酸溶液与1%氢氧化钠溶液，用前按95∶5比例混合）反应显橙红色，于494nm波长处来比色定量，如洋地黄中强心苷的含量测定。

（2）基于不饱和六元内酯的作用：C－17位上的不饱和六元内酯环是乙型强心苷的特征基团，它可以与异羟肟酸铁反应呈紫色，在535nm处有特征吸收，可据此来比色定量，如海葱苷甲的含量测定。

（3）基于与a－去氧糖的作用：①高氯酸法：样品与高氯酸溶液显色后在570nm处有特征吸收。②種吨氢醇法：样品与種吨氢醇试剂在沸水浴中加热3min则成红色，在550nm处比色，颜色至少稳定30min。③高氯酸黄详盐（flavyliumperchlorate）法：样品与高氯酸黄详盐试剂在沸水浴中加热30min，冷却10min后，在450nm处比色。

此外，还有肼基-2-苯骈噻唑法和硫代巴比妥酸（thiobarbituricacid）法。

2.高效液相色谱法

样品在进入HPLC柱前，必须经过预处理，以防杂质干扰及对色谱柱的污染，常用的方法有溶剂萃取法、预处理柱净化法及TLC净化法等。流动相多为甲醇—水，检测常用紫外检测器在220nm处检测。

例：HPLC法测定糖芥中强心苷含量（汪洋等，2005）

实验方法：色谱柱为ODS－C18；流动相为乙腈－水－甲醇（25∶60∶15）；柱温为室温；流速为1mL／min；检测波长为210nm。精密称取1.0g已粉碎糖芥种子，加人30mL石油醚超声10min去脂，然后用70%乙醇分别用室温冷浸、索氏提取、超声提取，提取至设定时间后停止。过滤，滤液经减压蒸馏浓缩分别得强心总苷浸膏。精密称取糖芥强心苷G对照品10mg于25mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取此溶液2、4、8、12、14、16、20μL，分别进样各三次，以对照样品进量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为A＝1415810.26C＋52716.43，相关系数r＝0.9995，线性范围为0.8～8μg。将室温冷浸、索氏提取、超声提取所有的干浸膏样品，各精密称取15mg，用甲醇溶解并分别定容于25mL容量瓶中，0.45μm滤膜过滤，在上述色谱条件下，分别进样10μL测定，据回归方程计算强心苷的含量。

（七）多糖类

多糖是由10个以上单糖基聚合而成。近年来，人们逐渐发现一些中药多糖有一些独特的、多方面的生理活性，且无毒性，是比较理想的药物。如昆布多糖有抗凝血作用；香菇多糖、茯苓多糖、黄芪多糖、人参多糖、黄精多糖、猪苓多糖都具有抗肿瘤作用和免疫促进作用。

测定多糖多用比色法，常用的显色剂有：苯酚—硫酸、蒽酮—硫酸和3，5-二硝基水杨酸（简称DNS）。苯酚－硫酸法原理是单糖、多糖和它们的衍生物与苯酚—硫酸试剂反应可生成橙黄色溶液，此溶液在490nm波长处有特征吸收。DNS法原理是3，5-二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖共热后还原成棕红色的氨基化合物，此氨基化合物在540nm波长处有特征吸收。蒽酮—硫酸法是根据多糖与其形成的溶液在625nm波长处有特征吸收。

如苯酚－硫酸法用于测定当归不同炮制品中的多糖含量（陆兔林等，1996）、蒺藜（全草、果实、根）中的多糖含量（师勤等，1997）及广金钱草的多糖含量（杨惠芝等，1996）。

李晓晖等则采用蒽酮－硫酸为显色剂，在721分光光度计上，于625nm波长处对不同产地、不同外形的灵芝及不同部位中的多糖含量进行了测定（李晓晖等）。

用苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法等比色法测定多糖含量，极容易受还原性杂质的干扰，若要消除这种干扰，可以采用间接碘量法。周采菊等采用此法测定了肾石消胶囊中槲叶多糖的含量（周采菊等，1996）。