氨基酸的定量测定

1. 氨基酸总量的测定

1)适用范围

适用于食品中的天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸十六种氨基酸的测定。其最低检出限为10pmol。

不适用于蛋白质含量低的水果、蔬菜、饮料和淀粉类食品中氨基酸测定。

2)原理

食品中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。

3)试剂和材料

①浓盐酸: 优级纯。

②6mol/L盐酸: 浓盐酸与水1 1混合。

③苯酚: 须重蒸馏。

④(0.0025mol/L)混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)。

⑤p H2.2的柠檬酸钠缓冲液: 称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5m L浓盐酸加水稀释到1000m L，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节p H至2.2。

⑥p H3.3的柠檬酸钠缓冲液: 称取19.6g柠檬酸钠和12m L浓盐酸加水稀释到1000 m L，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节p H至3.3。

⑦p H4.0的柠檬酸钠缓冲液: 称取19.6g柠檬酸钠和9m L浓盐酸加水稀释到1000m L，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节p H至4.0。

⑧p H3.3的柠檬酸钠缓冲液: 称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000m L，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节p H至6.4。

⑨p H5.2的乙酸锂溶液: 称取氢氧化锂(Li OH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279 m L，加水稀释到1000m L，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节p H至5.2。

⑩茚三酮溶液; 取150m L二甲基亚矾(C2H6OS)和乙酸锂溶液50m L加入4g水合茚三酮(C9H4O3·H2O)和0.12g还原茚三酮(C18H10O6·2H2O)搅拌至完全溶解。

高纯氮气:纯度99.99%。

4)仪器和设备

①真空泵。

②恒温干燥箱。

③水解管: 耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30m L。用去离子水冲洗干净并烘干。

④真空干燥器(温度可调节)。

⑤氨基酸自动分析仪。

5)试样处理

试样采集后用匀浆机打成匀浆(或者将试样尽量粉碎、于低温冰箱中冷冻保存，分析用时将其解冻后使用)。

6)分析步骤

(1)称样

准确称取一定量均匀性好的试样如奶粉等，精确到0.0001g(使试样蛋白质含量在10～20mg范围内); 均匀性差的试样如鲜肉等，为减少误差可适当增大称样量，测定前再稀释。将称好的试样放于水解管中。

(2)水解

在水解管内加6mol/L盐酸10～15m L(视试样蛋白质含量而定)，含水量高的试样(如牛奶)可加入等体积的浓盐酸，加入新蒸馏的苯酚3～4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5min，再接到真空泵的抽气管上，抽真空(接近0Pa)，然后充入高纯氮气; 再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在(110±1)℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。

打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 m L容量瓶内，用去离子水定容。吸取滤液1m L于5m L容量瓶内，用真空干燥器在40℃～50℃干燥，残留物用1～2m L水溶解，再干燥，反复进行两次，最后蒸干，用1m Lp H2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。

7)测定

准确吸取0.200m L混合氨基酸标准溶液，用p H2.2的缓冲液稀释到5m L，此标准稀释液浓度为5.00nmol/L，取50μL作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液的氨基酸含量。

8)结果计算

按式(9-4)计算:

式中: X——试样氨基酸的含量，单位为克每百克(g/100g);

C——试样测定液中氨基酸含量，单位为纳摩尔每50微升(nmol/50μL);

F——试样稀释倍数;

V——水解后试样定容体积，单位为毫升(m L);

M——氨基酸分子量;

m——试样质量，单位为克(g);

109是试样含量由纳克(ng)折算成克(g)的系数。

十六种氨基酸分子量: 天冬氨酸: 133.1; 苏氨酸: 119.1; 丝氨酸: 105.1; 谷氨酸:147.1; 脯氨酸: 115.1; 甘氨酸: 75.1; 丙氨酸: 89.1; 缬氨酸: 117.2; 蛋氨酸: 149.2; 异亮氨酸: 131.2; 亮氨酸: 131.2; 酪氨酸: 181.2; 苯丙氨酸: 165.2; 组氨酸: 155.2; 赖氨酸:146.2; 精氨酸: 174.2。

计算结果表示为: 试样氨基酸含量在1.00g/100g以下，保留两位有效数字; 含量在1.00g/100g以上，保留三位有效数字。

9)精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。

10)标准图谱

标准图谱见图9-3。

2. 甲醛滴定法

1)原理

氨基酸具有酸性的羧基(—COOH)和碱性的氨基(—NH2)，它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用标准强碱来滴定—COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。

图9－3 氨基酸标准图谱

表9－6 氨基酸出峰顺序及保留时间

2)方法特点及应用

此法简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近。在发酵工业中常用此法测定发酵液中氨基氮含量的变化，来了解可被微生物利用的氮源的量及利用情况，并以此作为控制发酵生产的指标之一。脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低; 酪氨酸含有酚羟基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高; 溶液中若有铵盐存在也可与甲醛反应，使结果偏高。

3)操作方法

吸取含氨基酸约20 mg的样品溶液于100 m L容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0m L置于200m L烧杯中，加水60m L，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNa OH标准溶液滴定至酸度计指示p H8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积，供计算总酸含量。

加入10.0m L甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至p H9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。

同时取80m L蒸馏水置于另一200m L洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至p H8.2 (此时不计碱消耗量)，再加入10.0m L中性甲醛溶液，用0.05mol/LNa OH标准溶液滴定至酸度计指示p H9.2，作为试剂空白试验。

4)结果计算

式中: X——试样中氨基酸态的含量，单位为克每100毫升(g/100m L);

V1——样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点(p H9.2)所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，m L;

V2——空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，m L;

c——Na OH标准溶液的浓度，mol/L;

M——测定用样品溶液相当于样品的质量，g;

0.014——N2的毫摩尔质量，g/mmol。

5)说明与注意事项

①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。

②浑浊和色深样液可不经处理而直接测定。

3.茚三酮比色法

1)原理

氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物(脯氨酸除外)，该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm，故据此可用分光吸光光度法测定样品中氨基酸含量。

2)操作方法

(1)标准曲线绘制

准确吸取200μg/m L的氨基酸标准溶液0.0m L，0.5m L，1.0m L，1.5m L，2.0m L，2.5 m L，3.0m L(相当于0μg，100μg，200μg，300μg，400μg，500μg，600μg氨基酸)，分别置于25m L容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0m L，然后加入茚三酮溶液(20g/L)和磷酸盐缓冲溶液(p H为8.04)各1m L，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的质量(μg)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品测定

吸取澄清的样品溶液1～4m L，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，用测得的A值在标准曲线上查得对应的氨基酸质量(μg)。

3)结果计算

式中: X——氨基酸含量，mg/100g

m——从标准曲线上查得的氨基酸的质量，μg;

m1——测定的样品溶液相当于样品的质量，g。

4)说明及注意事项

①通常采用的样品处理方法为: 准确称取粉碎样品5～10g或吸取样液样品5～10m L，置于烧杯中，加入50m L蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤。用30～40m L热水洗涤活性炭，收集滤液于100m L容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。

②茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化。

4. 非水溶液滴定法

1)原理

氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰乙酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸碱的质子学说: 一切能给出质子的物质为酸，能接收质子的物质为碱; 弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此，本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，则水中呈现中性，而在冰乙酸中就能接受质子显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。

本法适合于氨基酸成品的含量测定。可测定毫克级氨基酸。

2)分析步骤

①直接法(适用于能溶解于冰乙酸的氨基酸): 精确称取氨基酸样品50mg溶解于20m L冰乙酸中，加2滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L高氯酸标准液滴定(用10m L体积的微量滴定管)，终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰乙酸液，滴定至同样终点颜色。

②回滴法(适用于不易溶解于冰乙酸而能溶解于高氯酸的氨基酸): 精确称取氨基酸样品30～40mg，溶解于5m L、0.1mol/L高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩余的酸以乙酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不退的紫色为终点。

3)说明及注意事项

①能溶解于冰乙酸的氨基酸，可以用直接法测定的有: 丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰乙酸，但能溶解于高氯酸可以用回滴法测定的有: 赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。

②谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2m L甲酸中，再加20m L冰乙酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。