维生素的定量测定（，-二氯酚靛酚滴定法）

实验七　维生素C的定量测定（2，6-二氯酚靛酚滴定法）

实验目的

（1）学习维生素C定量测定的一般原理。

（2）掌握用2，6-二氯酚靛酚滴定法定量测定食物和生物体液中维生素C的基本操作技术。

（3）了解维生素C的生理意义及其在新鲜水果和蔬菜中的含量。

实验原理

维生素C是人类膳食中必需的维生素之一，如果缺乏维生素C，将导致坏血病发生，因此，维生素C又称为抗坏血酸，有防治坏血病的功效。维生素C在自然界中分布十分广泛，存在于新鲜水果和蔬菜中，尤其是在柠檬果实和一些蔬菜（如青辣椒、菠菜等）中含量特别丰富。

维生素C在机体内具有广泛的生理功能，已知体内许多重要物质的代谢反应都需要维生素C的参与，它是脯氨酸羟化酶的辅酶，故有增进胶原蛋白合成的作用。机体中许多含巯基的酶，需要依赖于作为还原剂的维生素C的保护，使酶分子的巯基处于还原状态，从而维持其催化活性。由于维生素C的氧化还原作用，它可促进免疫球蛋白的合成，增强机体的抵抗力，同时还能使氧化型谷胱甘肽转化为还原型谷胱甘肽（GSH），而GSH可与重金属结合而排出体外，因此维生素C常用于重金属的解毒。

维生素C是一种不饱和的多羟基内酯化合物，为稍有酸味的白色晶体，易溶于水，故属于水溶性维生素。在溶液中其分子内C₂和C₃之间的烯醇式羟基上的氢极易解离并释放出H＋，而被氧化成脱氢维生素C，氧化后仍具有维生素C的生理活性，但它易分解为二酮古洛糖酸，此化合物不再具有维生素C的生理活性。维生素C有很强的还原性，在碱性溶液中加热并有氧化剂存在时，易被氧化而破坏。还原型维生素C和氧化型维生素C可以互相转化，在生物组织中形成一个氧化还原系统。

由于维生素C在营养学和临床方面的重要意义，故对食物和生物体液中维生素C含量的测定是十分必要的。维生素C的定量测定方法有很多，有2，6-二氯酚靛酚（DCIP）滴定法、碘滴定法、2，4-二硝基苯肼法、Folin试剂比色法、紫外分光光度法等。其中广泛采用的是2，6-二氯酚靛酚滴定法，它具有简便、快速、较准确等优点，适用于许多不同类型样品的分析，其缺点是不能直接测定样品中的脱氢维生素C及维生素C的含量，易受其他还原物质的干扰。如果样品中含有色素类物质，将给滴定终点的观察造成困难。

在酸性环境中，维生素C（还原型）能将染料2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型2，6-二氯酚靛酚，而维生素C则被氧化成脱氢维生素C。氧化型2，6-二氯酚靛酚在中性或碱性溶液中呈蓝色，但在酸性溶液中则呈粉红色。因此，当用2，6-二氯酚靛酚滴定含有维生素C的酸性溶液时，在维生素C未被全部氧化前，滴下的2，6-二氯酚靛酚立即被还原成无色，一旦溶液中的维生素C全部被氧化时，则滴下微量过剩的2，6-二氯酚靛酚便立即使溶液显示淡粉红色或微红色，此时即为滴定终点，表示溶液中的维生素C刚刚全部被氧化。依据滴定时2，6-二氯酚靛酚标准溶液的消耗量，可以计算出被测样品中维生素C的含量。氧化型2，6-二氯酚靛酚与还原型维生素C常在稀草酸或偏磷酸溶液中进行反应，即先将被测样品溶于一定浓度的酸性溶液中或经抽提后，再用2，6-二氯酚靛酚标准溶液滴定至终点。其反应式如下：

食物和生物体液中常含有其他还原物质，其中有些还原物质可使2，6-二氯酚靛酚还原脱色。为了消除这些还原物质对定量测定的干扰，可用维生素C氧化酶处理，破坏样品中还原型维生素C后，再用2，6-二氯酚靛酚滴定样品中其他还原物质，然后从滴定未经酶处理样品时2，6-二氯酚靛酚标准溶液的总消耗量中，减去滴定非维生素C还原物质时2，6-二氯酚靛酚标准溶液的消耗量，即为滴定维生素C实际所消耗的2，6-二氯酚靛酚标准溶液的量，由此可以计算出样品中维生素C的含量。另外，还可利用维生素C和其他还原物质与2，6-二氯酚靛酚反应速度的差别，并通过控制样品溶液在pH值为1～3范围内，进行快速滴定，可以消除或减少其他还原物质的作用，一般在这样的条件下，干扰物质与2，6-二氯酚靛酚的反应是很慢的或是受到抑制的。

生物体液（如血液、尿液等）中的维生素C的测定比较困难，因为这些样品中维生素C的含量很低，并且存在许多还原物质的干扰，同时还必须预先进行脱蛋白质处理。在生物体液中含有巯基物质、亚硫酸盐及硫代硫酸盐等物质，它们都能与2，6-二氯酚靛酚反应，但反应速度比维生素C慢得多。样品中巯基物质对定量测定的干扰作用，通常可以通过加入对-氯汞苯甲酸（PCMB）而得到消除。

本实验采用2，6-二氯酚靛酚滴定法，以新鲜水果、蔬菜和生物体液作为分析材料，进行维生素C含量测定。

实验试剂与实验器材

1.实验试剂

（1）2%草酸溶液：草酸2g，溶于100mL蒸馏水中。2%草酸溶液也可用4%偏磷酸-乙酸溶液代替。

（2）1%草酸溶液：将1g草酸溶于100mL蒸馏水中。

（3）标准维生素C溶液：准确称取50.0mg纯维生素C，溶于1%草酸溶液，并稀释至500mL，保存于棕色瓶中，冷藏，最好临用时配制。

（4）1%盐酸溶液。

（5）0.1%2，6-二氯酚靛酚溶液：将250mg　2，6-二氯酚靛酚溶于150mL含有52mg NaHCO₃的热水中，冷却后加水稀释至250mL，滤去不溶物，保存于棕色瓶内，冷藏（4℃条件下可保存1～3周）。每次临用时稀释10倍，并以标准维生素C溶液标定。

（6）对-氯汞苯甲酸溶液（2mg／mL）：称取100mg对-氯汞苯甲酸，溶于50 mL 0.05mol／L　NaOH溶液中，过滤后的滤液保存备用（分析尿液样品用）。

（7）维生素C氧化酶（于-20℃条件下保存）。

（8）果汁（如橘子汁、柠檬汁、番茄汁等）。

（9）新鲜水果（如橙子、柚子、柠檬、草莓、山楂等）。

（10）新鲜蔬菜（如辣椒、菠菜等）。

（11）松针。

（12）生物体液（如血液、尿液等）。

2.实验器材

吸管、锥形瓶、抽滤装置、匀浆器、研钵、天平、容量瓶、组织捣碎机、微量滴定管等。

实验步骤

1.不同样品用不同方法提取后滴定

（1）果汁样品：将果汁充分摇匀后，取10mL果汁样品放入100mL容量瓶中，用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）稀释，并定容至100mL，混匀后通过快速滤纸过滤（或离心）。取滤液10mL放入锥形瓶内，立即用已标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液快速滴定至样品液呈现粉红色，并保持15～20s不褪色即为终点，记录所消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液的体积（mL）。样品液中维生素C含量宜在0.1～0.2mg／mL范围内，如果偏高或偏低则可酌情增减样品用量或进行适当稀释。另取10mL蒸馏水做空白对照滴定。样品液和空白对照液均至少各做3次，滴定结果取平均值，分别做好数据记录。

检测果汁（或其他样品）中干扰物质的存在，可取10mL新鲜果汁放入100 mL容量瓶中，加少许维生素C氧化酶晶体，轻轻混匀，放置15min，以破坏还原型维生素C，然后再加入2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）稀释至刻度，混匀后过滤，取此滤液10mL用2，6-二氯酚靛酚溶液进行滴定，记下消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液的体积（mL）。

（2）水果样品：将新鲜水果去皮，可食部分切成小块，称取50g水果样品置于匀浆器中或研钵内，加入25mL　2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）研磨，抽提液倒入100mL容量瓶中，残渣再加25mL　2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）研磨和抽提两次，每次抽提液均倒入容量瓶中，最后用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）定容至100mL，溶液混匀后用快速滤纸过滤或离心，取滤液（最初数毫升滤液弃去）或上清液10mL加入50mL锥形瓶内，随即用2，6-二氯酚靛酚溶液快速滴定至终点。取10mL　2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）做空白对照滴定，样品液和空白对照液各平行做3次。

（3）蔬菜样品：称取新鲜蔬菜150g，洗净后沥干并用纱布拭去其表面水分，切成碎块置于组织捣碎机内，加入100mL　2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液），捣碎2min。称取匀浆30g倒入100mL容量瓶中，用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）洗涤匀浆容器数次，洗液均转入容量瓶中，最后稀释至刻度。溶液混匀后用快速滤纸过滤（或离心），弃去最初滤出的滤液。如果样品颜色太深，可采用白陶土进行脱色处理。吸取滤液5mL放入锥形瓶中，立即用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液进行快速滴定，同时用2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液）做空白对照滴定，分别记下各次滴定所消耗的2，6-二氯酚靛酚溶液的体积（mL）。

（4）松针样品：称取松针1g，用水洗净后沥干并用滤纸吸去其表面水分，放在研钵中，加入适量1%盐酸溶液，充分研磨，静置后将上层抽提液倒入100 mL容量瓶中。如此反复研磨和抽提3次，最后用1%盐酸溶液稀释定容至刻度。溶液混匀后过滤或离心，取滤液5mL放入锥形瓶中，随即用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。另取5mL　1%盐酸溶液做空白对照滴定。

（5）生物体液样品：生物体液中维生素C的含量测定应采用新鲜样品，分析前样品必须制备成无蛋白质样品。向离心管中先加入4mL生物体液（如血液、尿液等），再加入6mL　2%草酸溶液（或4%偏磷酸-乙酸溶液），充分混匀，离心（3　500r／min）10min。取上清液8～9mL放入锥形瓶内，可直接用2，6-二氯酚靛酚标准溶液进行滴定。样品液和空白对照液至少平行各做3次，取其结果的平均值。

尿液样品在滴定前还必须用对-氯汞苯甲酸处理，即取9mL无蛋白质上清液放入离心管中，再加1mL对-氯汞苯甲酸溶液（2mg／mL），混匀后放置5～10min，然后离心10min，取上清液8～9mL放入锥形瓶内，用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定。

注意：各样品滴定过程宜迅速，一般时间不超过2min。滴定所用的染料不应少于1mL或多于4mL，如果样品含维生素C浓度太高或太低时，可酌情增减样品用量。

2.2，6-二氯酚靛酚溶液的标定

准确吸取标准维生素C溶液1.0mL（含0.1mg维生素C），置于100mL锥形瓶中，加9mL　1%草酸溶液，用微量滴定管以稀释10倍的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈淡粉红色，并保持15s不褪色即为终点。由所用染料的体积可计算出1mL染料相当于多少毫克维生素C。

3.计算

式中，T为1mL染料能氧化维生素C的量，mg／mL；W为10mL样品液相当于含样品的质量，g；VA为滴定样品时所消耗染料的体积（平均值），mL；VB为滴定空白对照液时所消耗染料的体积，mL。

注意事项

（1）市售的2，6-二氯酚靛酚质量不一，若杂质较多，应当提高其浓度，但也不宜过高，以滴定标准维生素C溶液时，染料用量在2mL左右为宜。

（2）样品中某些杂质也能还原2，6-二氯酚靛酚，但速度均较维生素C慢，故滴定终点以淡粉红色存在15s为准。

（3）2%草酸溶液可抑制维生素C氧化酶，1%草酸溶液浓度太低不能完成上述作用，4%偏磷酸-乙酸有同样的功效。

思考题

（1）提取维生素C时，加入2%草酸溶液或4%偏磷酸-乙酸溶液的作用是什么？

（2）如果提取液颜色太深而又无法脱尽，严重影响滴定终点判断时，是否有其他办法能准确判断出终点？（提示：可借助仪器）

（3）提取液中的维生素C氧化酶是否会影响本实验结果？能否加热消除该酶的影响？