用氨基酸全自动分析仪测定牛奶中的种氨基酸

一、 实验目的

（1） 了解氨基酸全自动分析仪的测量原理。

（2） 掌握测定氨基酸的分析方法。

二、 实验原理

蛋白质是人体必需的有机成分， 而氨基酸则是构成机体蛋白质的基本单位。 牛奶中的氨基酸主要有18种， 包括苏氨酸（Thr）、 缬氨酸（Val）、 亮氨酸（Leu）、 异亮氨酸（Ile）、 苯丙氨酸（Phe）、 蛋氨酸（Met）、 色氨酸（Trp）、 赖氨酸（Lys）、 组氨酸（His）、 甘氨酸（Gly）、 丝氨酸（Ser）、 丙氨酸（Ala）、 天冬氨酸（Asp）、 谷氨酸（Glu）、 酪氨酸（Tyr）、 脯氨酸（Pro）、胱氨酸（Cys） 和精氨酸（Arg）， 其中前9种为婴幼儿必需的氨基酸。 应用于氨基酸分析的方法很多， 包括柱后衍生高效阳离子交换色谱法、 柱前衍生反相高效液相色谱法、 高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等。 其中柱后衍生高效阳离子交换色谱法被认为是氨基酸分析的经典方法， 早在20世纪60年代初， 运用该法研制的氨基酸分析仪便已问世， 如今的氨基酸全自动分析仪早已实现了程序控制自动化和数据处理电脑化。

柱后衍生高效阳离子交换色谱法是样品经离子交换层析后， 各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色化合物，如图5-9所示。最大光吸收在波长570nm处，摩尔消光系数为2×104，茚三酮和二级胺（脯氨酸和羟脯氨酸）形成黄色产物， 在波440nm处检出， 摩尔消光系数为3×103。目前此法的灵敏度可达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保存，试剂本身黏性大， 需要有柱后混合器才能与氨基酸充分反应， 对仪器要求较高。

图5－9 氨基酸与茚三酮的反应

先用盐酸将奶粉中的蛋白质水解为游离氨基酸， 再通过氨基酸全自动分析仪对其中的16种氨基酸（Trp和Cys除外）进行测定。 通过盐酸水解、 氨基酸全自动分析仪能使奶粉中的16种氨基酸（Thr、 Val、 Leu、 Ile、 Phe、 Met、 Lys、 Gly、 Ser、 Ala、 Asp、 Glu、 Tyr、 His、Pro、 Arg）得到十分理想的分离效果。

三、 仪器和试剂

1. 仪器

（1） 电子分析天平；

（2） 电热恒温干燥箱；

（3） 真空干燥箱；

（4） SHZ-D （Ⅲ） 循环水多用真空泵；

（5） L-8900氨基酸全自动分析仪；

（6） 容量瓶；

（7） 烧杯；

（8） 搅拌棒；

（9） 三通管；

（10） 医用止血钳；

（11） 高纯氮气（99.99％） 钢瓶。

2. 试剂

（1） 氨基酸液体混标（各氨基酸含量均为2500μmol·L-1）；

（2） 茚三酮显色液；

（3） 16种氨基酸固体单标；

（4） 蛋白质水解分析缓冲液（p H-1＃、 p H-2＃、 p H-3＃、 p H-4＃）及再生溶液（p H-RG）（日本关东公司）；

（5） 去离子水。

四、 实验步骤

1. 样品前处理

称取混合均匀的奶粉0.1g（精确至0.0001g） 置于水解管中，加入10～15m L6mol·L-1的盐酸。接上真空泵抽真空10min至接近0Pa， 充氮气后用酒精喷灯烧管封口， 并将封口严密的水解管放在（110±1）℃的恒温干燥箱内水解22h后取出冷却。 打开水解管， 将水解液全部转入25m L容量瓶中， 用去离子水定容至刻度。 取滤液1m L置于25m L小烧杯中， 在40℃～50℃的真空干燥箱中烘干（如有残留物， 用1～2m L去离子水溶解， 再干燥）。 加入5m L0.02mol·L-1的盐酸溶液溶解，经0.22μm的滤膜过滤，作为待测液。

2. 定量分析

按仪器说明书上机操作， 用外标法定量， 进样量为20μL。 检测波长440nm（VIS2）用于检测Pro， 检测波长570nm（VIS1）用于检测除Pro外的其他氨基酸。

由16种氨基酸固体单标的0.1mol·L-1的HCl溶液确定氨基酸的种类。

用0.1mol·L-1的HCl溶液将原装氨基酸混标液分别稀释成浓度为12.5μmol·L-1、25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1、150μmol·L-1、200μmol·L-1、250μmol· L-1的溶液，上机进样测定，得到相应的峰面积，以标样质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标， 分别绘制出16种氨基酸的标准曲线， 从而获得相应的回归方程和线性相关系数。

将待测液进样， 利用标准曲线查出奶粉中各种氨基酸的含量。

思 考 题

试述柱后衍生高效阳离子交换色谱法的原理。