自动生化分析仪的分析方法

自动生化分析仪的应用不仅是操作方法的变化,而且由于引进一系列高精技术,所用的方法测定原理都有迅速的发展。目前自动生化分析仪的分析方法主要有终点法(平衡法)、连续检测法(动态法)和固定时间法(两点法)等。

(一)终点法

1.终点法的特点 被测物质在反应过程中完全被转化为产物,即达到反应终点,根据终点吸光度的大小求出被测物浓度,称为终点法。但实际上被测物并没有完全被转化,而是与产物达到一个动态的化学平衡,故又称平衡法。终点法的优点是参数设置简单,精密度较好。缺点是反应时间一般较长,不适用于离心式自动分析仪。

终点时间的确定首先要根据时间-吸光度曲线,如Trinder反应测定尿酸,反应曲线上3~ 5min其吸光度已趋向稳定,可将5min作为反应终点;其次要结合干扰物的反应情况,如溴甲酚绿法测定血清清蛋白,清蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应,之后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生“慢反应”,使反应曲线上的吸光度在10s后仍继续缓慢上升,持续约达10min,因此终点时间应采用10~30s,而不选择10min。

2.终点法的分类 可分为一点终点法和两点终点法。

(1)一点终点法:反应到达终点,在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值,又称一点终点法。常用于钙、磷、镁、葡萄糖、总胆固醇、三酰甘油等测定等。计算公式:待测物浓度C U=(待测吸光度A U-试剂空白吸光度A B)×K,K为校准系数。

(2)两点终点法:在被测物反应或指示反应尚未开始时,选择第一个吸光度(A 1),当反应到达终点或平衡时选择第二个吸光度(A 2),两点吸光度之差用于计算结果,称为两点终点法,能有效消除溶血、黄疸和脂浊等标本光吸收造成的干扰。如总胆红素(氧化法或重氮法)、结合胆红素(氧化法或重氮法)、血清总蛋白(双缩脲法)、血清清蛋白(溴甲酚氯法)、总胆汁酸测定等。计算公式:待测物浓度C U=(待测吸光度A 2-待测吸光度A 1)×K。

(二)连续监测法

连续监测法又称速率法。是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时,连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值,并以此线性期的单位吸光度变化值(ΔA/min)计算结果。所谓线性期就是各点吸光度差值相等,该期对底物来说属零级反应。优点是能确定线性期,速度快、准确性高。

该法常用于酶活性测定,如谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转肽酶、淀粉酶和肌酸激酶等。

(三)固定时间法

又称两点法,指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点,既非反应初始吸光度亦非终点吸光度,两点吸光度的差值用于结果计算,称为固定时间法,其计算公式与两点终点法相同,为待测物浓度C U=(待测吸光度A 2-待测吸光度A 1)×K。

该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题。如苦味酸法测定肌酐,反应的最初30s内,血清中快反应干扰物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能与碱性苦味酸反应;在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应,且此段时间-吸光度曲线的线性较好(故也可用连续监测法测定肌酐);在80~120s及其以后,碱性苦味酸可与蛋白质及其他慢反应干扰物反应。选用反应的第二个30s为测定时间,既避免了快反应物质的干扰,也避免了慢反应物质的影响,使肌酐浓度与吸光度变化呈良好的线性关系,有利于提高分析的特异性和准确度。

透射比浊分析和均相酶免疫分析法是近年随着检验技术、分子生物学和标记技术的发展,应用于生化自动分析仪测定的新方法。