茚三酮法测定氨基酸的含量

一、目的要求

1．了解茚三酮与氨基酸反应的原理。

2．掌握茚三酮显色法测定氨基酸含量的原理。

二、实验原理

含有自由氨基的化合物如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时生成氨，氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物，该化合物颜色的深浅与氨基的含量成正比，可通过测定570 nm处的吸光度，因而可用比色法测定氨基酸、多肽或者蛋白质的含量。其中氨基酸与茚三酮的反应包含两个重要步骤：第一步，氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，茚三酮则被还原成还原型茚三酮；第二步，形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。

三、仪器与试剂

1．仪器

721型分光光度计、水浴锅、电子天平、p H计、真空泵、试管、滴管、量筒、烧杯、漏斗、铁架台。

2．试剂

（1）标准氨基酸溶液：称取适量赖氨酸，配制成0.3 mmol/L标准氨基酸溶液，并密封保存，以避免被空气中NH3所污染。

（2）p H5.4、2 mol/L醋酸缓冲液：量取86 m L 2 mol/L醋酸钠溶液，加入14 m L 2 mol/L冰醋酸，调p H值至5.4。

（3）茚三酮显色液：称取85 mg茚三酮和15 mg还原茚三酮，用10 m L乙二醇甲醚溶解。茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶：称取5 g茚三酮溶于15～25 m L热蒸馏水中，加入0.25 g活性炭，轻轻搅拌。加热30 min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1 m L冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

（4）60%乙醇。

（5）样品液：每毫升水中含有0.5～50 μg氨基酸。

四、实验操作与步骤

1．标准曲线的制作

分别取0.3 mmol/L的标准氨基酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L于试管中，用蒸馏水补足至1 m L。各加入1 m L p H5.4、2 mol/L醋酸缓冲液；再加入1 m L茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，100℃水浴中加热15 min，用自来水冷却。放置5 min后，加入3 m L 60%乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD570 nm吸光度值（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440 nm）。以OD570 nm吸光度值为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

2．氨基酸样品的测定

取样品液1 m L，加入p H5.4、2 mol/L醋酸缓冲液1 m L和茚三酮显色液1 m L，混匀后于100℃沸水浴中加热15 min，自来水冷却。放置5 min后，加3 m L 60%乙醇稀释，摇匀后测定OD570 nm（生成的颜色在60 min内稳定，要求在60 min内完成测定）。根据样品的OD570 nm吸光度值，以标准曲线函数计算样品中氨基酸含量。

五、实验说明

（1）实验操作时，避免茚三酮与皮肤接触。

（2）茚三酮与样品加热后必须用水冷却，之后再进行后续的操作与测定。

（3）样品与茚三酮混合后需要充分震荡混匀。

（4）标准曲线需要计算回归方程，在使用回归方程时候一定注意其适用范围。

六、思考题

1．为何测定氨基酸含量时，茚三酮与氨基酸反应需要在弱酸性环境下进行？

2．如果待测样品中含有蛋白质，是否需要除去蛋白质才能测定样品中的游离氨基酸？

3．思考茚三酮与氨基酸反应可以应用到哪些领域？