主要的定量方法

近年来研究和应用较多的定量PCR方法主要有外对照定量PCR、极限稀释法、内对照定量PCR、竞争性定量PCR和荧光定量PCR。

这几种方法各有利弊，对其选择取决于实验目的、靶基因的特性、靶序列分子数的估计范围、准确度的要求、需要相对还是绝对定量。

1.外对照定量PCR　外对照定量PCR，即测量PCR产物的数量，是最简单的定量PCR方法。不同样品的PCR产量是可以测定的，运用这个结果可推算每份样品在PCR扩增开始时的靶DNA相对量。作为外对照的标准，通常与待测DNA序列相近或相同的DNA序列，外对照标准能与样品中的靶序列在不同的扩增体系中平行扩增。根据这个标准稀释系列PCR产物与起始物量的线性关系，在同一PCR扩增循环中的样品靶序列的起始量相对值即可推测出来。对于RNA的定量，通常是采用其cDNA作为外对照标准。由于采用与待测基因相同的引物进行扩增，并且扩增片段的长度相同，减少了PCR扩增过程中扩增效率的差异。但这个定量过程必须在指数扩增期进行，并且要对一个反应过程中多个时间点的产物量进行线性回归分析。通过这种方法可以消除管与管之间的差异，但不能消除样本与样本之间的差异。外对照定量PCR虽然相对简单，但实验的精确性和可重复性较差。因此，采用外对照定量PCR时，要分析实验的精确性和可重复性。目前已较少使用。

2.极限稀释法　极限稀释法又称终点稀释法，是通过稀释阳性标本直至靶基因不能再扩增为止。稀释程度可用来计算起始靶基因的分子数。该方法具有操作简便，灵敏度高的特点。这种分析方法的一个重要优点是定量不依赖扩增效率，但每个样品需要多次PCR反应，工作量很大。并且要取得可靠结果，必须满足以下几个严格条件：①优化反应条件，使检测具有可重复性，一个或几个靶分子能被稳定检测出；②对每个稀释度作多次PCR，其结果用统计学的Poisson分布进行分析；③必须严格避免污染以免造成假阳性结果。

3.非竞争性对照基因定量法　非竞争性对照基因定量法，即靶基因与参照基因的同步扩增，且此参照基因序列与靶序列不同，引物也不一样，可作为一个内部参照标准来对目的基因进行定量。由于定量的目的核酸样本中往往含有大量的非目的序列DNA或 RNA，这就为目的序列和细胞中的某个特异序列在同一个PCR管中共同扩增提供了方便。这个特异序列即为内对照。内对照在样品中DNA量、扩增效率、电泳时的上样量都易于标准化。只要严格控制反应条件，可以对目的基因进行精确定量。该方法的优点是可以消除管与管之间的变异，并在一定程度上能够消除样本与样本之间的变异，但最好定量处于指数扩增期。

4.竞争性定量PCR　竞争性定量PCR是靶序列与一个已知浓度的内参照在同一反应管中竞争性地共同扩增，两者使用相同引物，靶序列和内参照共同竞争引物、核苷酸和聚合酶。由于竞争作用，当一种模板量逐渐增加时，另一种模板扩增产量逐渐减少。两种模板PCR产物的比值与两种初始状态时核酸含量的比值有关。当两种模板的拷贝数相等时，它们的扩增产物也基本相当，反应体系中内部标准的量也就代表了被检测模板的量。由于反应过程中竞争模板的扩增效率与靶序列扩增效率相同，扩增就不一定限制在指数扩增期内。这是竞争PCR技术最大的优点之一。对于RNA定量，可以通过RT-PCR方法。竞争性定量PCR能消除管间及样本间的变异，重复性好，定量范围较广，结果比较可靠，是目前较为理想的一种定量PCR方法。使用竞争性定量PCR，主要的问题是构建竞争模板，竞争模板可以通过修改靶序列的克隆来构建。竞争模板的长度一般要与目的模板相差200个bp左右，既可以保证竞争模板与目的模板扩增效率相同，又保证扩增产物在电泳时能明显分开有利于检测。

5.荧光定量PCR　荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)又称实时(real time)荧光定量PCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面可以在每次PCR循环收集数据，建立实时扩增曲线，准确地确定域值循环数(Ct值)，计算起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。我们将在下面详细介绍。