实验38 酶标免疫定量测定
(Enzyme-labeled immune quantitative determination)
【目的】
了解酶标免疫定量测定的基本原理和方法。
【原理】
酶标免疫定量测定是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记定量技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性和抗原性，也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时，酶能催化产生有颜色的产物，颜色的有无及深浅能反映相应的抗原或抗体是否存在及其量的多少。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是一类常用的酶标免疫定量测定，可用于测定抗体，也可用于检测抗原。该实验常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)，底物为邻苯二胺(OPD)。实验方法有间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。本实验为双抗体夹心法(测人血清中的IgG含量)，该法多用于检测多价大分子抗原，但不能用于检测半抗原等小分子物质。
【材料】
1.待检病人血清。
2.已知IgG含量的参考蛋白。
3.抗人IgG抗体。
4. HRP标记的抗人IgG抗体。
6.稀释液:含10％牛血清白蛋白，pH7.4 0.01mol/LPBS。
7.洗涤液: pH7.4，0.01mol/LPBS-吐温20。
8.底物溶液: OPD-H2O2
9.终止液: 2mol/LH2SO4。
10. 96孔酶标反应板。
【方法】
1.包被:将抗人IgG抗体用包被液作适当稀释(1∶100)，在96孔反应板中每孔加100μl，置湿盒内，4℃过夜。
2.洗涤:将96孔反应倾去包被液，用洗涤液加满各孔，静置3min，倾去，如此反复3次。
3.加样:
(1)将已知IgG含量的参考蛋白用稀释液配成不同的梯度浓度，分别加入1～7孔，每孔100μl。
(2)第8孔加待检血清100μl。
(3)第9孔加阴性对照血清100μl。
(4)第10孔加PBS-T20液100μl，为空白对照。加样后: 96孔板置37℃孵育1h。
4.洗涤3次(同上)。
5.加HRP标记的抗人IgG抗体(其PBS-T20稀释度根据预试结果而定)，每孔100μl。
6. 37℃孵育1h。
7.洗涤3次(同上)。
8.显色:加新鲜配制的底物溶液，每孔100μl，在室温下避光放置15min。
9.终止反应:每孔加终止液50μl。
10.以酶标光度计495nm测各孔OD值。
【结果】
空白对照及阴性对照应无色。各阳性反应孔呈棕黄色，参考蛋白各孔呈明显的颜色深浅梯度。
以参考蛋白各稀释度IgG的含量为横坐标，相应OD值为纵坐标，绘制标准曲线。依据待检血清所测得的OD值，从标准曲线中求出其IgG含量。
【注意事项】
1.在加已稀释的标准抗体时，应从低浓度的第一管开始加，避免将高浓度的抗体带入低浓度的孔中引起误差。
2.应尽量避免孔中有气泡，以免所测得OD值不准确。
【思考题】
某一抗原只有一个抗原表位时，是否能做双抗体夹心法检测其含量?
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