任务2 动物细胞培养用品的清洗、消毒和灭菌
清洗与消毒灭菌是细胞培养的第一步，也是细胞培养中工作量最大、最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大的关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何对细胞生长不利的毒性物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0.1μg，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品须采用不同的灭菌方法。如果选用的方法不当，使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值，即使达到了无菌效果也不行。
一、培养用品的清洗
清洗工作是细胞培养实验室最为重要的工作，也是最为繁重和艰辛的工作。目前我国某些细胞培养实验室仍使用能反复利用的玻璃器皿和塑料制品，这样就需要对这些培养用器材进行清洗。清洗的主要目的是清除各种器材上携带的杂质和微生物，使器材上不残留任何影响细胞生长的成分，因而在细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的工作。
在细胞培养过程中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。微生物产品附带杂物、上次细胞残留物及非营养成分的化学物质均能影响培养细胞的生长。因此，对新使用和再次使用的培养器皿都要严格、彻底地清洗，且要根据器皿组成材料的不同，选择不同的清洗方法。
1.玻璃器皿的清洗
一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
（1）浸泡。
初次使用和已使用过的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶解掉。初次使用的玻璃器皿，表面带有生产和运输过程中落下的大量的灰尘，且玻璃表面常呈碱性并带有一些对细胞有害的物质等。新玻璃器皿在使用前应先用自来水简单刷洗，然后用2%～5%HCl溶液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。
再次使用的玻璃器皿表面常附着一些细胞、蛋白杂质，干涸后极难脱落，故用后的玻璃器皿须立即浸入水中。浸泡时玻璃器皿要完全浸入，瓶内不能留有气泡，也不能浮在液面上。
注意事项：①强酸、强碱、琼脂等能腐蚀或阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废物缸内；②一般的器皿都可用去污粉、肥皂或5%的热肥皂水（热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污）来清洗。沾有很多油脂的器皿应先将油脂擦去。沾有焦油及树脂一类物质的器皿，可用浓硫酸、40%氢氧化钠溶液浸泡；③吸取过血清、Hank′s等含糖溶液或含酚红染料溶液的玻璃吸管（包括毛细吸管），使用后应立即投入盛有自来水的洗盆内，免得干燥后难以冲洗干净，若吸管顶部塞有棉花，则冲洗前先将吸管尖端与装在水龙头上的橡皮管连接，用水将棉花冲出，然后进行洗涤；④用过的载玻片与盖玻片如滴有香柏油，要先用皱纹纸擦去香柏油或浸没于二甲苯内摇晃几次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5～10min，用软布或脱脂棉花擦拭，立即用自来水冲洗，然后在稀洗涤液中浸泡0.5～2h，用自来水冲去洗涤液，最后用蒸馏水换洗数次，待干后浸于95%酒精中保存备用，使用时在火焰上烧去酒精，用此法洗涤和保存的载玻片和盖玻片清洁透亮，没有水珠。
（2）刷洗。
浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷蘸洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。注意不能使用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿，刷洗时动作要适度，以防损害器皿表面光泽度及留下划痕。
（3）浸酸。
刷洗后的玻璃器皿自然干燥或烤干后要浸泡于清洁液中，浸泡时间一般为过夜，不得少于6h。
清洁液由重铬酸钾（或重铬酸钠）、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成，用清洁液处理玻璃器皿的过程称为浸酸。清洁液可根据需要，配制成不同的强度，常用的有下列三种：强清洁液、次强清洗液和弱清洁液。具体配方如表1-5所示。
表1-5 各强度清洁液的配方
清洁液的配制：首先将重铬酸钾固体粉末溶解于蒸馏水中，缓慢加热使其充分溶解，待重铬酸钾溶液冷却后徐徐加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动以帮助散热，并注意防止液体外溢。
清洁液的工作原理：重铬酸钾与硫酸作用后形成铬酸，铬酸的氧化能力极强，从而使清洁液具有极强的去污作用。
清洁液使用注意事项：①清洁液中的浓硫酸具有强腐蚀作用，玻璃器皿在其中浸泡时间太长，会使玻璃变质，因此切忌长时间浸泡玻璃器皿；②若清洁液沾污衣服或皮肤，应立即用清水冲洗，再用苏打水或氨水溶液冲洗，如果溅到桌椅上，应立即用水洗去或用湿布抹去；③玻璃器皿投入清洁液前，应尽量保持干燥，以避免清洁液被稀释；④清洁液的使用范围仅限于玻璃和瓷质器皿，不适用于金属和塑料制品；⑤携带有大量有机物质的器皿应先将有机物质擦洗掉，然后浸泡于清洁液中，因为有机物质太多会加快清洁液的失效，此外，清洁液虽为强去污剂，但也不是所有的污迹都可清除；⑥清洁液一般盛放于陶瓷容器内，平时应加盖保护，以防变质；⑦新配制的清洁液为棕红色，被还原之后的清洁液为墨绿色，其去污能力将大大降低，不可再用；⑧无论是在清洁液中浸泡物品还是捞取物品，均须戴耐酸手套和穿围裙，动作要缓慢，并要保护好面部及其他身体裸露部分，要定期检查耐酸手套，防止它被玻璃碎片扎破漏液，从而发生危险。
（4）冲洗。
浸酸后的玻璃器皿必须用水充分冲洗，使之不残留任何污物或清洁液。冲洗最好用洗涤装置，既省力效果又好。如手工操作，则需流水冲洗10次以上，每次灌满2／3体积的水然后倒干净，再用蒸馏水和超纯水分别清洗3～5次，等待灭菌处理。
玻璃器皿经以上步骤洗涤后，若内壁的水均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用清洁液浸泡数小时，然后用自来水、蒸馏水、超纯水充分冲洗。
2.瓶塞的清洗
细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理。常规清洗方法如下：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2%NaOH溶液或洗衣粉煮沸10～20min，以去除蛋白质；自来水冲洗后，再用1% HCl溶液浸泡30min或蒸馏水冲洗后再煮沸10～20min，晾干备用。旧胶塞不必用酸碱处理，可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，再用蒸馏水和超纯水清洗，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
3.塑料制品的清洗
塑料制品现多采用无毒并经特殊处理的包装，打开包装即可使用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH溶液浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%HCl溶液浸泡30min，最后用自来水、蒸馏水和超纯水冲洗干净，晾干备用。
二、包装
为防止消毒灭菌后再次遭受污染，培养用品在消毒处理前要经严格包装。清洗后的器皿可先放入鼓风干燥箱中吹干（塑料和橡胶制品不能放入干燥箱），或置于通风、无灰尘处自然晾干，然后包装起来，再做消毒处理。包装后的器皿便于消毒和储存。常用的包装材料有包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝盒和特制玻璃或金属制的消毒筒（长度能容纳吸管）、纸绳等。印有字的纸张和棉纸不宜用于包装。
1.局部包装
体积较大的细胞培养瓶、烧杯、容量瓶、三角瓶、滤器、消毒筒等以及体积较小，但瓶口包装方便的容器（如青霉素瓶等）的包装，只把瓶口部分用硫酸纸包裹后，再罩以牛皮纸或棉布密包起来用线绳扎紧即可。
2.全包装
比较小的细胞培养瓶、吸管、金属器械和胶塞等，需采用全包装，现多采用将其装入铝盒的方法。铝盒封闭小培养瓶、胶帽和胶塞等效果很好，但因盖不紧，故使用期限不宜太长。铝盒不透明，需在盖上写明用品名称以便于辨认。一些较大的物品如大容量三角瓶等，可用双层包装纸或布包裹起来。吸管在装入消毒筒前，先用少许脱脂棉将吸管手持端堵塞，松紧度应适宜，过松则易脱落，过紧则不透气，妨碍使用，然后装入消毒筒中；消毒筒底部应垫以软纸或棉花，以防吸管装入时折断管尖。
3.金属器械的包装
一般金属器械（如剪刀、镊子）需置于铝盒中进行消毒灭菌。具体的做法如下：常规清洗铝盒，最后用超纯水冲洗2～3次；在铝盒内垫一层纱布（纱布的大小应能完全包裹所灭器械），将清洗干净的器械置于纱布上后，用纱布的另一端包裹，并在最上边放置一把镊子，用于灭菌后器械的安全取放。一般一个工作小组所用的器械包装于一个铝盒内，以防止交叉污染。
三、消毒灭菌
动物细胞培养最大的危险是发生培养物的细菌、真菌或病毒等微生物的污染，污染主要是由于操作者不规范操作而引起，主要包括操作间或周围环境污染、培养器皿和培养液消毒不彻底等。由于细胞培养的任一环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作规程，以防止发生任何污染。
1.消毒方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌方法可分为物理灭菌法和化学灭菌法两大类。物理灭菌法包括高压蒸汽灭菌法、紫外线消毒法、过滤除菌法、高能量射线法、离心沉淀法和干热灭菌法。而高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法统称为加热灭菌，加热灭菌是物理方法中最常用的一种方法。其具体工作原理是通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀灭微生物的目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需的温度越低。在同一温度下，湿热杀菌法的效力高于干热灭菌法的效力，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热灭菌时热穿透力强，可增加灭菌效力。
（1）高压蒸汽灭菌法。
高压蒸汽灭菌法用途广泛，效率较高，是细胞培养工作中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05 kg／cm2（表压，103.5kPa）时，蒸汽的温度升高到121℃，经15～30min可杀灭高压锅内物品上携带的各种微生物及可能存在的芽孢。
适用对象：能经高压灭菌的培养用液、培养瓶塞与瓶盖、塑料滤器等。
（2）紫外线消毒法。
紫外线常用于空气、操作台表面、超净工作台和不能使用其他方法进行消毒的培养器皿的消毒。紫外线照射直接方便、效果好，经一定时间照射后，可杀灭空气中大部分细菌。细胞培养实验室安装的紫外灯距地面应不超过2.5m，且需消毒的物品不能相互遮挡，紫外线的穿透能力非常弱，但其电离产生的氧自由基可消毒光线直射不到的地方。
紫外线消毒注意事项：①紫外线辐射能量低，穿透力弱，仅能杀灭直接照射到的微生物，因此消毒时必须使消毒部位充分暴露于紫外线下；②用紫外线消毒纸张、织物等粗糙表面时，要适当延长照射时间，且两面均应照射；③紫外线消毒的适宜温度范围是20～40℃，温度过高或过低均会影响消毒效果，如果温度较低或较高可适当延长消毒时间，用于空气消毒时，消毒环境的相对湿度应低于80%，否则应适当延长照射时间；④在使用过程中，应保持紫外灯表面的清洁，一般每两周用酒精棉球擦拭一次，发现灯管表面有灰尘、油污时，应随时擦拭；⑤用紫外灯消毒室内空气时，房间内应保持清洁干燥，减少尘埃和水雾；⑥不得让紫外线照射到人，以免引起损伤。
（3）化学消毒法。
最常见的是70%酒精和1‰新洁尔灭，前者主要用于操作者的皮肤、操作台表面及无菌室内壁的处理，后者则主要用于器械的浸泡、皮肤和操作室壁面的擦拭消毒。化学消毒法操作简单、方便有效。
（4）过滤除菌法。
对酶、活性因子、血清等具有生物活性的液体不能使用高压蒸汽灭菌法、化学消毒法等常规方法进行消毒灭菌，这时需选用过滤除菌法。该方法是利用滤器的滤膜将被消毒液体中的微生物过滤除去，从而达到除菌的目的。
2.灭菌后的处理
灭菌后的处理如下：①检查包装的完整性，若有破损，不可作为无菌包使用；②湿包和有明显水渍的包不可作为无菌包使用；③检查化学灭菌指示胶带变色情况，未达到变色要求或有可疑点者，不可作为无菌包使用；④灭菌包掉落在地，或误放于不洁之处，或沾有水液，均应视为受到污染，不可作为无菌包使用；⑤已灭菌的物品不得与未灭菌物品混放；⑥合格的灭菌物品，应标明灭菌日期、合格标志；⑦运送无菌物品的工具应每日清洗并保持清洁干燥，当怀疑或发现有污染时，应立即进行清洗消毒，物品顺序摆放，并加防尘罩，以防再污染；⑧灭菌后的物品，应放入洁净区的柜橱内（或架子上、推车内）；⑨储存的有效期受包装材料、封口的严密性、灭菌条件、储存环境等诸多因素影响，对于棉布包装材料和开启式容器，一般建议，温度在25℃以下时有效期为10～14d，潮湿多雨季节有效期应缩短，对于其他包装材料如一次性无纺布、一次性纸塑包装材料，如证实该包装材料能阻挡微生物渗入，其有效期可相应延长，至少为半年以上。
知识拓展
生产中所用器皿的清洗、消毒
生产上进行细胞培养时，所用器皿有不同的处理方法。在进行细胞复苏、小量培养时仍用卡氏培养瓶，处理方法同上，但大多用一次性塑料培养瓶，可免处理。在进行小规模培养时，大多用转瓶。转瓶可用传统方法清洗，也可用专门的清洗机进行清洗。现在市场上有售的洗、烘、灌一体机（图1-41）由立式超声波洗瓶机、杀菌干燥机、灌轧机组成，可完成超声波清洗、冲水、充气、烘干消毒、灌装等工序。在进行大规模细胞培养时用的生物反应器都带有自动清洗、消毒和灌装的程序。
图1-41 生产过程中洗、烘、灌一体机
思考题
1.清洁液的配制方法和注意事项有哪些？
2.细胞培养中常用的消毒灭菌方法有哪些？
3.如何判定所用器皿灭菌合格与否？
4.如何对细胞培养用塑料制品进行消毒？
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