消毒灭菌技术

项目一　消毒灭菌技术

一、培养基灭菌技术

食用菌菌种生产中最关键的技术就是消毒灭菌技术。每一个环节都要注意控制杂菌污染，做好消毒灭菌，以保障生产优质菌种。

食用菌菌种生产中的消毒灭菌主要是控制有害的微生物。

（一）消毒灭菌方法概述

消毒灭菌根据其原理不同可以分为物理方法和化学方法两大类。物理方法又分为加热灭菌、辐射灭菌、过滤除菌和干燥灭菌等（见图6－1）。化学方法主要指利用各种化学药剂进行消毒、灭菌或防腐，常用的化学药剂种类很多，原理也各不相同，这些化学药剂又分别称为灭菌剂、消毒剂、防腐剂，它们之间有时也没有严格的界限。在实际生产中消毒、灭菌或防腐稍微有些差异。

图6－1　物理灭菌方法

灭菌通常指采用某种强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施，包括病原微生物和非病原微生物。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。消毒是指利用某种方法杀死物质中所有病原微生物的一种措施，而对食用菌生产来说，主要是杀死杂菌。如用化学药剂进行消毒，则将此化学药剂称为消毒剂。

防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长繁殖的一种措施。它能防止产品腐败或物质霉变，这是一种抑菌作用。例如日常生活中以干燥、低温、盐腌或糖渍等方法防腐。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。灭菌、消毒与防腐的比较见表6－1。

表6－1　灭菌、消毒与防腐的比较

加热灭菌属于物理方法，也是最常用的方法。

微生物细胞的蛋白质、核酸等大分子物质对高温非常敏感。当环境温度超过微生物的最高生长温度时，将会引起微生物死亡，所以加热是最有效的控制微生物的物理方法。不同微生物的最高生长温度不同，不同生长阶段的微生物抗热性也不同，因此根据不同对象，通过控制处理的温度和时间达到灭菌或消毒的目的。

（二）食用菌培养基常用的消毒灭菌方法

食用菌的菌种分三级，其培养基也分为三级。无论哪一级菌种的培养基，都需要经过消毒灭菌使之成为无菌状态。因菌种培养基多为固体、半固体或液体，所以上述消毒灭菌方法也有所选择，常用的主要是湿热灭菌法和过滤除菌法。当然现在也采用微波、电磁炉、紫外线隧道等先进灭菌技术。

1.巴氏消毒法

巴氏消毒法最早由法国微生物学家巴斯德采用，是常用于牛奶、啤酒、果酒、酱油、醋与食品等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌，而又不影响食品的营养和风味。巴氏消毒法是一种中温消毒法，具体的处理温度和时间各不相同，一般在60～85℃下处理15s至30min。具体的方法可分两类：一类是经典的低温维持法（LTH），将待消毒的物品，在60～63℃下加热30min或70℃下加热15min，例如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是高温瞬时法（HTST），消毒时只需将待消毒物品（如牛奶）在71.6℃保持15s。近年来，由于设备的改良，尤其是采用流动连续操作系统后，巴氏消毒法逐渐演化成一种采用更高温度、更短时间的灭菌方法，即超高温巴斯德灭菌法，让牛奶等液体食品停留在140℃左右（如137℃或143℃）的温度下保持3～4s，急剧冷却至75℃，然后经均质化后冷却至20℃。这种方法能达到灭菌的目的，而且处理后的牛奶等饮料可存放长达6个月。

食用菌的菌种培养基不常用巴氏消毒法，有时在原料处理时进行发酵，相当于巴氏消毒法。这是利用发酵料堆中的生物热达到60～70℃，杀死原料中的杂菌、害虫及虫卵，并且使原料腐熟，以便接种后菌种的菌丝快速萌发生长。

2.高压蒸汽灭菌法

高压蒸汽灭菌法也称常规加压灭菌法。本法是目前应用最广、最有效的灭菌方法，适用于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物料的灭菌。

3.常压蒸汽灭菌法

常压蒸汽灭菌法用于大规模生产的培养基灭菌。让培养基（料）在常压灭菌锅、灶或炉中连续不断地进行加热，产生100℃蒸汽，维持8～16h，有时制种量大还需延长至24h。这是利用自然压力的蒸汽灭菌的方法。可用土蒸锅、蒸笼等灭菌。由于常压下蒸汽温度较高压下的低，故灭菌时间要长些。此法的优点是设备结构简单、成本低、便于自制，适宜于农村制种推广。

4.微波灭菌法

微波是指频率在300～300000MHz的电磁波，介于普通的无线电波和红外辐射之间。微波的杀菌作用主要是微波的热效应造成的。微生物在微波的作用下，吸收微波的能量产生热效应，同时，微波造成分子运动加速，使细胞内部受到损害，从而导致微生物死亡。微波产生热效应的特点是加热均匀、热能利用率高、渗透能力强、加热时间短，可以利用微波进行培养基灭菌和酒精消毒等。

5.过滤除菌

高压蒸汽灭菌可以除去液体培养基中的微生物，但对于空气和不耐热的液体培养基的灭菌是不适宜的，为此设计了过滤除菌的方法。过滤除菌有三种类型。最早使用的一种是在一个容器的两层滤板中间填充棉花、玻璃纤维或石棉，灭菌后空气通过它就可以达到除菌的目的。为了缩小这种滤器的体积，后来改进为在两层滤板之间放入多层滤纸，灭菌后使用，也可以达到除菌的作用。这种除菌方式主要用于发酵工业。第二种是膜滤器（见图6－2），这是目前常用的一种方法。膜滤器采用微孔滤膜作材料，通常采用由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的比较坚韧的具有微孔（0.025～25nm）的膜。当含有微生物的液体通过微孔滤膜时，大于滤膜孔径的微生物不能通过滤膜而被阻拦在膜上，与通过的滤液分离开来。微孔滤膜具有孔径小、价格低、可高压灭菌、不易阻塞、滤速快、可处理大容量的液体等优点。但当滤膜孔径小于0.22nm时易引起孔阻塞，且过滤除菌无法滤除病毒、噬菌体和支原体。第三种是核孔滤器，它是由核辐射出来的很薄的聚碳酸胶片再经化学蚀刻而制成。辐射使胶片局部破坏，化学蚀刻使被破坏的部位成孔，而孔的大小由蚀刻溶液的强度和蚀刻的时间来控制。溶液通过这种滤器时就可以将微生物除去。这种滤器主要用于科学研究。

图6－2　膜滤器装置及其过滤除菌示意图

过滤除菌可用于对热敏感液体的除菌，如含有酶或维生素的溶液、血清等。发酵工业上应用的大量无菌空气也是采用过滤方法获得的，使空气通过铺放多层棉花和活性炭的过滤器或超细玻璃纤维纸，便可滤除空气中的微生物。

二、接种环境、用具的消毒灭菌

食用菌的菌种生产中，接种环境、用具的消毒灭菌也可以分为物理方法和化学方法两大类。有时两类方法都用，做到“双管齐下”，达到无菌操作的目的。

（一）环境的消毒灭菌

1.设备

接种环境的消毒灭菌方式与设备有关，常见的有接种箱、接种室、超净工作台、负离子发生器。

接种箱、接种室要求安装紫外线灭菌灯及日光灯。

超净工作台是利用过滤灭菌的原理，先将空气过滤，得到无菌空气，然后将无菌空气从风洞处打出，使工作台范围内成无菌状态。工作台上顶也安装紫外线灭菌灯及日光灯。

2.原理

（1）负离子发生器是采用强电离对空气进行灭菌的一种新方式。通过电离使菌体蛋白质和核酸变性死亡，灭菌效果较理想。

（2）紫外线灯照射消毒灭菌。

①原理：紫外线是日光的一部分，波长在100～400nm，其中257nm波长的紫外光对微生物最具杀伤力。当微生物被紫外光照射时，细胞的DNA吸收能量，形成胸腺嘧啶二聚体，此时腺嘌呤无法正确配对，从而干扰DNA的复制和蛋白质的合成，造成微生物的死亡。当照射剂量或时间不足时，可能引起微生物变异。

不同的微生物或微生物的不同生理状态对紫外线的抵抗力是不同的。一般来说，革兰氏阴性菌对紫外线最为敏感，革兰氏阳性菌次之。营养细胞对紫外线的抵抗力弱于芽孢。酵母菌在对数生长期对紫外线的抵抗力最强，而在长期缺氧的情况下抵抗力最弱。

②使用紫外线灯照射消毒灭菌的注意事项。

a.使用时要提前30min开灯照射，同时设置黑暗环境。

b.紫外线的穿透力很弱，易被固形物吸收，不能透过较厚的玻璃和纸张。因此，只适用于表面消毒和空气、水的消毒。实际应用时，可以按1W/m³来计算剂量。若以面积来计算，30W紫外线灯用于15m²房间照射20～30min即可杀死空气中的微生物，因此紫外线灯广泛应用于接种室、微生物化验室、医院、公共场所的环境空气消毒。

c.当空气中湿度超过55%时，紫外线的杀菌效果迅速下降。

d.必须防止紫外线对人体的直接照射，以免损伤皮肤和眼结膜。

e.紫外线可能诱导产生环境中的有害变化而间接影响微生物生长，如使空气中产生臭氧，水中产生过氧化氢，培养基中产生有机的过氧化物等。

（3）化学药剂消毒法。这是利用化学药剂进行杀菌的方法。选用不同的化学药剂对特定环境进行喷雾、擦洗或熏蒸。杀菌剂的种类及使用浓度如下。

①重金属盐类：所有的重金属盐类对微生物都有毒害作用，如硝酸银、氯化汞等。

②氧化剂：常用的氧化剂有高锰酸钾、过氧化氢、漂白粉、漂白精等，常用的高锰酸钾溶液浓度是0.1%，氯气自来水清洁剂浓度为1mg/L，漂白精浓度为400mg/L。

③有机化合物：5%甲醛溶液用于种子表面消毒，甲醛原液可用于接种箱、培养室、栽培室等空间消毒，熏蒸用量为6～10mL/cm³；0.25%新洁尔灭溶液可用于皮肤、种子消毒。

（二）接种用具的消毒灭菌

接种用具主要指金属制的工具、玻璃器皿、耐高温的塑料用具等，具体包括：基本器具，如试管、菌种瓶、塑料袋、孢子收集器、天平、培养皿、漏斗、纱布；接种环、钩、铁铲；刀片、镊子、剪刀等。

菌种瓶一般是容量为750mL、口径为3cm的玻璃瓶，也有用普通罐头瓶、广口瓶的，效果以前种规格为好。但均要求能耐高温、高压，并要无色透明，以便检查菌丝生长和杂菌污染情况。

常用的消毒灭菌方法如下。

1.干热灭菌法

干热灭菌法包括火焰灼烧法和烘烤灭菌法。

（1）火焰灼烧法是直接利用火焰将微生物杀死的方法，它适用于金属制的工具、玻璃器皿口等的灭菌。常用的如酒精灯火焰灭菌，其优点是快捷、彻底，其缺点是有时火焰灼烧对用具有破坏性。

（2）烘烤灭菌法是利用热空气进行灭菌的方法。灭菌温度为140～170℃，灭菌时间为2～3h，此法只适用于金属及玻璃器皿的灭菌。电热干燥箱是干热灭菌常用的设备。其优点是方便、彻底，其缺点是器皿、工具需要先包装严密再放入灭菌。

2.紫外线灯照射消毒灭菌

方法及注意事项同上所述。

3.化学药剂消毒法

这是利用化学药剂进行消毒杀菌的方法。选用不同的化学药剂对工具进行浸泡、擦洗等。杀菌剂的种类及使用浓度如上所述。

4.沸水消毒法

沸水消毒法主要用于金属制的工具、玻璃器皿、耐高温的塑料用具等器材的消毒，将有关的器材置于沸水中煮一定时间，以杀死微生物的营养体。