最有效的物理消毒灭菌方法

消毒与灭菌_微生物实验实训

任务5　消毒与灭菌

在微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌的污染，因此对所有器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

1．基本概念

1）防腐

防腐是指在某些化学物质或物理因子的作用下，使物体内外的微生物暂时处于不生长、不繁殖但又未死亡的状态，是一种抑菌作用。如采用低温、干燥、盐渍、糖渍等保藏食品的方法就是防腐。具有防腐作用的化学物质称为防腐剂。

2）消毒

消毒是指应用物理或化学的方法杀死物体上或环境中绝大部分微生物（特别是病原微生物）的措施，可达到防止传染病传播的目的。物品消毒处理后，虽仍有少数微生物未被杀死，但已不能引起有害作用。具有消毒作用的物质称为消毒剂，常用于牛奶、食品及某些物品的表面消毒。消毒剂的杀菌作用是有限的，并不是所有的消毒剂都能将各种病原微生物杀死。

3）灭菌

灭菌是指用物理或化学的方法杀死或除去物品上或环境中的所有微生物，包括耐热性的芽孢和孢子。灭菌后的物体无可存活的微生物，否则就是灭菌不彻底。

4）无菌

无菌是指没有具有生命力的微生物存在。只有通过彻底灭菌，才能达到无菌要求。因此，灭菌是对物品的作用，而无菌则是描述物品的状态。灭菌是无菌的先决条件，无菌是灭菌后的结果。

消毒灭菌的方法很多，大致可分为物理因素除菌法和化学因素除菌法两种。为了达到无菌的效果，应根据微生物的特点、待灭菌材料与实验目的和要求来选用具体的方法。

2．物理因素

常用的利用物理因素除菌的方法有加热除菌、辐射除菌、过滤除菌等。

1）温度

利用温度进行灭菌是最常用的、方便有效的方法。高温相对于低温对细菌的致死作用更为显著，高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起到灭菌作用，低温通常起抑菌作用。所以采用高温灭菌是一种有效且可靠的灭菌方法，通常的加热灭菌方法包括干热灭菌和湿热灭菌。

（1）干热灭菌法。

干热是指相对湿度在20%以下的高热，干热灭菌法包括火焰灼烧法、焚烧法及干热空气灭菌法等。

①灼烧灭菌法：该法是利用火焰灼烧时，200℃以上的火焰温度可使微生物的营养体和芽孢在短时间内迅速炭化。此法简便可靠，灭菌彻底，但由于大部分物品经灼烧易损坏，所以使用范围有限。一般只用于接种环、接种针、试管口、瓶口及镊子等工具或物品进行灭菌，使其满足无菌操作的要求，确保纯培养时不受污染。此法还适用于对污染物品、带菌物品或试验动物尸体等废弃物的焚烧灭菌，但需在专用的焚烧炉内进行。

需要注意的是，灭菌时应先将接种针置于火焰外焰上过渡处理后再转移到内焰上彻底灼烧，从而避免直接灼烧湿的微生物引起爆散，污染操作环境。

②干热空气灭菌法：即是在烘箱或烤箱内利用加热的高温空气进行灭菌的方法。目前常用的灭菌条件大致为140～160℃维持2～3h。该方法缺点是穿透力弱，温度不均匀，而且由于灭菌温度过高，所以使用受限，仅适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌，而培养基、橡胶制品、塑料制品等都不能用干热灭菌。

干热灭菌的具体操作方法如下：

将待灭菌的物品用牛皮纸、布袋或金属桶包好后放入烘箱内，不要紧靠四壁，不要放得过紧太满，以免妨碍热空气流通；关闭烘箱门，打开通气孔，以便排除箱内冷空气和水汽；接通电源加热，箱内温度升到100～150℃时关闭通气孔，继续加热，直至箱内温度达到要求时，恒温持续一段时间；关闭电源，停止加热，待箱内温度下降到60℃以下时，打开箱门，取出灭菌物品。

（2）湿热灭菌法。

湿热灭菌主要通过加热煮沸或热蒸汽杀灭微生物。在同样温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性，另一方面高温蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而使菌体迅速死亡，另外，湿热蒸汽有潜热的存在。常用的湿热灭菌法有巴氏消毒法、煮沸消毒法、间歇灭菌法和高压蒸汽灭菌法。

①巴氏消毒法：最早由法国微生物学家巴斯德发现而得名。因某些食物在高温下其营养成分或是质量会受到较大影响，如牛奶、啤酒、酱油等，所以只能用较低的温度来杀死其中的病原微生物，这样既可以保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。一般常用的条件为60～85℃，加热30min，应用温度与时间必须相适应，具体温度和时间应根据不同的物品的性状及试验决定。

②煮沸消毒法：直接将需要消毒灭菌的物品放入水中，将水煮沸，保持15min左右，即可杀死细菌的全部营养体和部分芽孢。若在水中加入1%～2%碳酸氢钠或是2%～5%石炭酸，能增强杀菌作用，效果更好。该法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

③间歇灭菌法：又称为分段灭菌法，该方法是根据芽孢生长特性而设计的，因为芽孢比营养体耐高温，但芽孢成长为营养体后，耐高温的特性就会消失，所以反复灭菌、培养、再灭菌，即可彻底杀死芽孢。因此，使用该方法在前次灭菌后，必须把被灭菌物品放在适于芽孢萌发的条件下进行培养，否则芽孢不萌发，达不到杀菌的目的。具体做法是将待灭菌的物品加热至100℃15～30min，杀死其中的营养体；然后冷却，放入37℃恒温箱中过夜，让残留的芽孢萌发成营养体；第二天再加热重复上述步骤，三天左右就可达到灭菌的目的。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，花费时间较长。

④高压蒸汽灭菌法：也称加压蒸汽灭菌法或饱和蒸汽灭菌法。单纯的加压不能灭菌，但加压能提高灭菌温度，实现灭菌的目的。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌锅内121℃、0．105MPa、20～30min条件下进行的，其原理是水在密闭的锅内煮沸后，产生蒸汽，将锅内空气排尽后，使蒸汽不能逸出，锅内的蒸汽压力增加，则水的沸点也随着上升，因而能得到比100℃更高的蒸汽温度用来进行有效地灭菌。该法可用于培养基、生理盐水、废弃的培养物以及耐高热药品、纱布、采样器械等的灭菌。

（3）低温的抑菌作用。

微生物对低温的抵抗力一般较高温强，虽然低温能使部分微生物死亡，但不少微生物当环境温度低于微生物生长最低温度时，只是代谢速率降低，进入休眠状态，原生质结构通常不被破坏，不会很快死亡，且能在较长的时间内保存其生命力，待温度提高后，仍可恢复正常的生命活动。因此，低温具有抑制微生物生长的作用，故低温保藏食品是最常用的方法。

2）辐射

利用辐射进行灭菌消毒，可以避免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点。与微生物生长有关的辐射主要有紫外线辐射（波长100～400nm）和电离辐射（波长小于100nm）。

（1）紫外线辐射。

紫外线的波长小于可见光，其中波长为260nm的紫外线杀菌能力最强，人工制作的紫外灯产生253．7nm的紫外线杀菌能力强且稳定。

紫外线辐射属非电离辐射，波长短，透过物质的能力很差，穿透作用微弱，一般只适用于空气消毒、器皿表面的消毒及微生物育种的诱变剂。实际工作中常用于无菌室、接种箱、手术室、食品车间、药物包装室内的空气及物体表面的灭菌。

紫外线的灭菌作用一是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；二是空气在紫外灯照射下，可导致臭氧（O₃）等过氧化物产生，辅助杀菌。经紫外线辐射处理后，受损伤的微生物细胞若再暴露于可见光中，一部分可恢复正常，此现象称为光复活现象。为避免发生此现象，紫外线照射后的分离培养工作必须在避光下进行。

按紫外线来源不同可将紫外消毒灭菌分为紫外灯管消毒和日光消毒两种。紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比，即与所用紫外灯的功率、照射距离和照射的时间有关。需注意的是，紫外线会损伤皮肤和眼结膜，在有人员操作时应将紫外线灯关掉；应定期进行空气细菌培养，以检查灭菌效果。

（2）电离辐射。

高能电磁波如X射线、α射线、β射线和γ射线，具有较高的能量与穿透力，可在常温下对不耐热的物品进行灭菌，故又称“冷杀菌”。电离辐射的杀菌作用除作用于细胞内大分子，如X射线、γ射线能引起染色体畸变等外，还可通过射线引起环境中水分子和细胞中水分子在吸收能量后产生自由基而起作用，这些游离基与细胞中的敏感大分子反应并使之失活。

不同微生物对放射线的抵抗力不同，一般来说耐热性强的微生物对放射线的抵抗力也大，细菌芽孢的抵抗力大于酵母，酵母的抵抗力大于霉菌和细菌营养体，革兰氏阳性菌的抗辐射性较强。

3）过滤

过滤除菌是将带菌的液体或气体通过一个滤器的装置，利用机械阻留和静电吸附作用使杂菌留在滤器或滤板上。此法适用于一些不宜加热灭菌的液体物质或培养基，如抗生素、血清、疫苗、毒素等。该法的最大优点是不破坏液体或培养基中各种物质的化学成分，用于除菌的细菌过滤器一般多采用抽气减压的方法进行操作。

细菌过滤器的类型主要有以下几种（图2－5）。

图2－5　常用滤菌器

（a）滤膜过滤器；（b）玻璃过滤器；（c）蔡氏过滤器；（d）硅藻土过滤器；（e）瓷土过滤器

（1）滤膜过滤器。

滤膜过滤器是利用一定孔径的混合纤维酯薄膜为过滤介质，通过正压、负压及自然压力过滤的一种滤器。滤膜是火胶棉、乙酸纤维素等物质做成的薄膜，使用时将薄膜放在类似布氏漏斗的特制滤器上即可进行过滤。滤膜孔径大小不一，依用途而选定，一般选用0．22～0．45μm孔径的滤膜。由于滤膜不重复使用，大小可选，处理方便，因此滤膜过滤器已成为处理多种液体最有效、方便的过滤除菌设备。

（2）玻璃过滤器。

玻璃过滤器的整个滤菌器是由玻璃制成的，滤板是用玻璃细砂在一定温度下烧结加压而成，滤板和漏斗黏合在一起。滤菌器孔径大小不一，其规格见表2－3。

表2－3　玻璃滤菌器的型号及用途

（3）蔡氏（Seitz）过滤器。

蔡氏过滤器是由金属制成的滤器，包括石棉制成的滤板和一个特制的漏斗，按孔径大小可分为K型、EK型、EK－S型等。其中，K型孔径最大，用于澄清；EK型孔径较小，常用来除去一般细菌；EK－S型滤孔最小，可阻止大病毒通过。

（4）硅藻土过滤器。

该滤菌器是用硅藻土压制成的空心圆柱体，底部连接在金属板上，中央有金属导管导出圆柱体外，圆柱体外装有玻璃套筒，将待过滤的液体放于玻璃套筒和圆柱体之间，圆柱底的金属导管上插有橡皮塞，可连接抽气瓶。

硅藻土过滤器按孔径大小分为V、N、W三种型号。V型滤菌器孔径最大，为8～12μm；N型孔径为5～7μm；W型过滤器的孔径为3～4μm。

（5）瓷土过滤器。

这种滤菌器是用未上釉的陶瓷制成的空心圆柱体，一端开口，液体由漏斗灌入柱心，因抽气作用，液体慢慢滤过，而细菌被截留，不能通过滤器。

瓷土过滤器按滤孔的大小可分为L₁、L₁bis、L₂、L₃、L₅、L₇、L₉、L₁₁及L₁₃等9级。其中，L₁孔径最大，细菌可以通过；L₃的滤器孔径较小，能截留细菌；之后的滤器孔径依次减小，L₁₃的孔径最小。

3．化学因素

利用化学药品进行灭菌也是非常重要的灭菌手段。按化学药物的效应，可将其分为消毒剂、防腐剂及化学治疗剂等。

1）消毒剂、防腐剂

消毒剂是指可以杀死致病菌和其他有害微生物的化学药品，通常用于非生物材料的灭菌或消毒。防腐剂是指能杀死微生物或抑制其生长，但对人及动物的体表组织无毒性或毒性低，可作为外用抗微生物药物。

（1）作用原理。

不同化学药物的作用原理是不完全相同的，对微生物的影响常以其中一方面为主，兼有其他方面的作用，主要包括：改变细胞膜的通透性；蛋白质变性或凝固；改变蛋白质与核酸的功能基团，药物作用于细胞内酶的功能基（如巯基），导致酶被改变或被抑制活性；改变原生质的胶体形状，使菌体发生沉淀或凝固。

（2）常用种类、使用浓度及用途。

消毒剂按其化学性质可分为：无机酸、碱及盐类；重金属盐类，如汞盐、银盐等；氧化剂，如高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸及臭氧等；卤素及其化合物，如氯、氟、漂白粉、碘等；有机化合物，如酚类、醇类、甲醛、有机酸及有机盐等；表面活性剂，如新洁尔灭等；矿质元素，如硫黄。

①无机酸类：包括盐酸、硫酸、硼酸、硝酸等。该类消毒剂的特点是腐蚀性较强，穿透力较差，且不同微生物对氢离子浓度的敏感性不同，一般细菌比真菌更易受到影响，消毒时应根据菌种选择相应电离程度的酸类。消毒剂溶液的温度对酸类作用的影响较大，温度每升高10℃，杀菌力提高1～2倍。

②无机碱类：包括生石灰、氢氧化钠、碳酸钠。该类消毒剂的特点是可杀灭细菌繁殖体、芽孢，对病毒有较强的杀灭作用，对寄生虫卵也有杀灭作用，但易灼伤组织，有腐蚀性，不适用于水的消毒，极易吸湿受潮，杀毒范围窄，粗制品含量低。

生石灰在使用时，应加水使其变为具有杀菌作用的Ca（OH）₂，即熟石灰。如果被消毒物是液体，可直接加入生石灰，1%的石灰水在数小时内可杀死普通无芽孢杆菌，3%的石灰水在1h内可杀死伤寒杆菌。

氢氧化钠具有显著的杀菌作用，但由于其溶液腐蚀性大，有机物的存在可降低消毒效果；无表面活性作用；腐蚀金属，破坏环境，一般只用于地面、仓库等地的消毒。2%～4%的氢氧化钠溶液能杀死病毒和细菌的营养体，30%的溶液在10min内可杀死炭疽杆菌的芽孢，若再加入10%的氯化钠，可增强致死芽孢能力。

碳酸钠，又称苏打，1%～2%的苏打水具有弱杀菌作用，一般情况下很少作为独立的消毒剂使用，主要作为消毒剂的辅助剂。

③无机盐类：盐溶液的杀菌能力与其浓度成正比，除此以外，还与盐类本身的特性、pH、温度、金属离子的化合价及微生物的种类有关。常用的硫酸铜是防治真菌的良好消毒剂，浓度低于2%可直接喷洒物体表面；由硫酸铜、石灰、水按1∶1∶100配制成波尔多溶液，是良好的表面消毒剂。

④重金属盐类：包括升汞和银盐。升汞有很强的灭菌作用，常用浓度为千分之一（升汞1g，盐酸2．5mL，混合后加水稀释至1000mL），用于无菌箱、无菌室喷雾消毒或擦拭玻璃器皿、木质试管架等非金属制品和非橡胶制品，不适于对含有蛋白质较多的带菌物品进行消毒。升汞对人体有毒，使用时需注意，可用复红着色加以识别，现已逐渐被人工合成的硫柳汞灭菌剂代替。银盐具有很强的杀菌力，常用硝酸银，如将1%的硝酸银溶液滴入新生儿眼中，可防止淋球菌的感染。

⑤氧化剂：包括高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸、臭氧。该类消毒剂的特点是作用快而强，不残留，广谱杀菌，对细菌、霉菌、病毒和芽孢均有效，但只对表面有作用，易分解，不稳定。

高锰酸钾具有很强的氧化能力，0．1%的高锰酸钾溶液常用于皮肤、水果、炊具的消毒。在酸性溶液中，其氧化作用增强，如果用1%高锰酸钾溶液和1%盐酸混合，可在30s内破坏炭疽杆菌的芽孢，而当遇到还原性物质时则被还原成二氧化锰，杀菌作用消失。

过氧化氢是一种无毒的消毒剂，氧化能力很强，极不稳定，易水解生成分子氧和水，分子氧具有杀菌作用。3%的过氧化氢水溶液可洗涤细菌污染的器具，也可进行口腔黏膜消毒。

过氧乙酸是无色透明液体，有刺激性酸味和腐蚀、漂白作用，是强氧化剂，杀菌能力强，常配制18%过氧乙酸（冰乙酸300mL、浓硫酸15．8mL，装于一塑料瓶中，另一瓶装150mL过氧化氢，需要时将两瓶混合摇匀，静置3天）备用。用0．04%溶液浸泡衣服2h；洗手用0．2%溶液，可杀灭各种病毒，是肝炎病毒较好的消毒剂；表面喷洒用0．2%～1%溶液作用30～60min；用0．5%溶液可对房间进行喷雾消毒；用具洗净后可用0．5%～1%溶液浸泡30～60min；用15%溶液加等量水，加热蒸发，可对房间进行熏蒸消毒。

臭氧用于空气消毒时，人员须离开现场，消毒结束后20～30min方可进入。臭氧平均最高容许浓度为0．1mg／m³，浓度过低难以达到净化效果，过高则对人体有害，对其浓度的有效控制增加了其使用的难度，不利于广泛应用。但臭氧溶于水时杀菌作用更为明显，常用于水的消毒，饮用水消毒时加臭氧量为每升0．5～1．5mg，维持10min；水质较差时，可加大臭氧的量为每升3～6mg。

⑥卤素及其化合物：该类消毒剂通过卤化、氧化作用使有机物分解或丧失功能，但对金属腐蚀性大，用量大，使用条件受限，易分解。氯气常用于水的消毒，常用剂量为0．2%～1mg／kg。氯溶于水后形成盐酸和次氯酸，次氯酸是反应活泼的化合物，可放出氧，从而杀死细胞。气体氯和熟石灰反应所得的白色粉末称为漂白粉，主要成分有CaCl₂、Ca（OH）₂、Ca（ClO）₂。常用浓度为0．2%，用于浸泡、清洗、擦拭、喷洒墙面；0．5%～1%的漂白粉水溶液在5min内可杀死大多数细菌；1／5～2／5量的干漂白粉加入待处理固形物中搅拌均匀，放置1～2h即可达到良好的消毒灭菌效果。但漂白粉在消毒过程中，易与有机物反应生成有机氯化物，对人体产生“三致效应”，现已逐渐被具有安全、高效、光谱作用的新型二氧化氯消毒剂代替。

⑦有机化合物：酚类常用苯酚，又称石炭酸。0．5%的溶液可作为防腐剂，2%～5%的溶液可抑制和杀死大部分细菌的营养体；5%溶液的灭菌作用同升汞相似，在数小时内可杀死细菌的芽孢，一般用于无菌室喷雾或器皿及排泄物的消毒。使用时，不可用手接触石炭酸，否则易发生皮肤知觉神经麻痹，亦不可与食品接触。将肥皂乳化甲酚的混合液称为来苏尔，它的灭菌效果比石炭酸强，且对皮肤的刺激性小，2%的溶液可用于皮肤消毒，3%～5%的溶液可用来处理微生物实验的废弃物。

醇类常用的消毒剂是乙醇，乙醇的杀菌力与其本身的浓度有关。一般70%～75%浓度最有效，若太低则达不到杀菌作用，太高反而会使菌体表面蛋白质凝固，形成一层膜，妨碍乙醇进入细胞膜，达不到灭菌目的。

醛类常用的是甲醛，一般消毒用浓度为37%～40%溶液，具有腐蚀性，刺激性强。0．1%～0．2%的甲醛溶液能杀死细菌的营养体；5%的甲醛溶液在1～2h内可杀死炭疽杆菌的芽孢；40%甲醛水溶液又称福尔马林，主要用于熏蒸消毒，能杀灭芽孢，对细菌繁殖体效果更好。

有机酸的杀菌性能由整个分子或阴离子部分起作用，一般有机酸的电离度比无机酸低，杀菌作用反而比无机酸强。包括苯甲酸或苯甲酸钠，山梨酸及其钾盐和钠盐，丙酸及其钙盐和钠盐，乙酸，以及乳酸等。

苯甲酸或苯甲酸钠是酸类食品中常用的防腐剂，主要抑制真菌的生长，尤其对酵母的抑制作用较强。使用它作为防腐剂时，必须注意食品的pH低于4．5时才有效，当pH大于5．5时，几乎没有抑菌效果。食品中的最大允许添加量为0．1%，一般常用于果汁、果酱和其他酸性饮料中。

山梨酸及其钾盐和钠盐在pH　4．5以下时对酵母菌有较好的抑菌效果，对霉菌效果更好，对细菌抑菌作用差。一般适用于果酱和非醇饮料，最高允许添加量为0．1%。

丙酸及其盐类属于抑霉菌剂，可有效抑制霉菌的生长，但须在酸性条件下才可表现出抑菌作用，对酵母菌无效，最高允许添加量不超过0．32%。

3%乙酸溶液于15min内可杀死沙门氏菌，4%的浓度可杀死大肠杆菌，9%的浓度可杀死金黄色葡萄球菌，浓度为6%时可有效抑制腐败菌的生长。

乳酸的抑菌作用比乙酸弱，但比苯甲酸要强很多。0．3%的浓度可杀死铜绿假单胞菌，0．6%的浓度可杀死伤寒杆菌，2．25%的浓度可杀死大肠杆菌。实际生产中，也可利用乳酸熏蒸或喷雾来对空气进行消毒。

⑧表面活性剂：该类消毒剂可降低液体表面张力，吸附在微生物的表面，使菌体细胞膜的通透性改变，进而使原生质暴露出来，起到灭菌作用和防蛀抑霉作用。常用的新洁尔灭是一种阳离子季铵盐，易溶于水，常用浓度为0．25%的水溶液，用于皮肤和小型器皿的表面消毒，与其他消毒剂配合使用可提高杀菌效果和杀菌速度，有去污、杀菌作用，只对细菌有效，对病毒几乎无效，毒性低，对人体组织无刺激性。

⑨矿质元素：硫熏蒸是通过硫燃烧产生SO₂，然后与水作用生成亚硫酸，附着在菌体细胞上，与菌体上的氧形成硫酸，同时使微生物脱氧，造成菌体的死亡。硫黄的用量一般为2～3g／m³。二氧化硫具有强烈的刺激性和毒性，使用时须注意安全，防止中毒。

2）化学治疗剂

（1）抗代谢物。

有些化合物在结构上与生物体所必需的生长因子很相似，可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物（antimetabolite）。最常用的是磺胺类药物，抗菌谱广，能治疗多种传染性疾病，对大多数革兰氏阳性菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌）、某些革兰氏阴性菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）和部分放线菌有一定的作用。

（2）抗生素。

抗生素是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响别种生物的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长。

作用机理：抑制细菌细胞壁合成；破坏细胞质膜；作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化；抑制蛋白质和核酸合成等。