革兰阳性菌

第一节　革兰阳性菌

一、葡萄球菌（Staphylococcus）

葡萄球菌广泛分布于空气、水、土壤及物体表面，在人和动物的皮肤、黏膜、消化道、呼吸道、乳腺中也有分布。根据其生理特性和化学组成将葡萄球菌属分为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及腐生葡萄球菌。以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为例介绍致病性葡萄球菌的主要特性。

（一）生物学特性

1.形态与结构：葡萄球菌为革兰阳性球菌，直径为0.5～1.um，因常排列呈葡萄串状而得名。金黄色葡萄球菌在固体培养基上常呈葡萄串状排列（图15-1），在脓汁或液体培养基中，常排列成双球或短链状，易被误认为链球菌。本菌无鞭毛，不产芽胞，一般不形成荚膜。

2.培养特性：需氧或兼性厌氧。本菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，若加入血液或葡萄糖，生长更为旺盛；在肉汤培养基中呈均匀浑浊生长。在普通琼脂平板上形成湿润、光滑、隆起的圆形菌落。菌落颜色依菌株而异，初呈灰白色，继而为金黄色、白色或柠檬色。多数致病性葡萄球菌产生溶血素，在血液琼脂平板上形成明显的溶血环，非致病性葡萄球菌则无溶血现象。

多数菌株能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。能分解甘露醇产酸。葡萄球菌均可产生触酶，金黄色葡萄球菌还能产生凝固酶和耐热核酸酶（DNA酶），据此可将金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌相区别。

图15-1　金黄色葡萄球菌的血涂片

3.抗原结构与分类：葡萄球菌抗原构造复杂，含有多糖及蛋白质两类抗原。蛋白质抗原主要为A蛋白（SPA），是大多数金黄色葡萄球菌共有的一种特异的表面抗原，为单链多肽，与肽聚糖共价结合。SPA能与几乎所有哺乳动物的血清IgG分子Fc段非特异性结合，结合后的IgG仍能与相应抗原发生特异性反应，SPA的这一性质已被广泛应用于免疫诊断技术。多糖类抗原可用于葡萄球菌的定型。

4.抵抗力：在无芽胞菌中，葡萄球菌抵抗力较强。耐盐性强，在含15％氯化钠的培养基上仍能生长。在干燥的脓汁中可存活2～3个月，80℃min才被杀死。3％～5％的石炭酸、75％乙醇、1％～3％结晶紫对此菌均有良好的消毒效果。对青霉素、庆大霉素、磺胺类药物等敏感，但易产生耐药性。

（二）致病性

金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶，致病性强。能产生溶血毒素、肠毒素、杀白细胞素、毒素休克综合征毒素等毒素及血浆凝固酶、DNA酶、溶纤维蛋白酶（葡激酶）、透明质酸酶、磷酸酶等酶类。常引起两类疾病，一类为化脓性疾病，如创伤感染、脓肿、蜂窝织炎、乳腺炎、关节炎及脓毒败血症等；另一类为毒素性疾病，被葡萄球菌污染的食物或饲料可引起人或动物的中毒性呕吐、肠炎及人的毒素休克综合征等。

（三）微生物学诊断

根据不同的病型采集不同的标本，如化脓性病灶取脓汁或渗出物，败血症取血液，乳腺炎取乳汁，食物中毒取可疑食物、呕吐物及粪便等。

1.涂片镜检：将病料直接涂片，染色镜检，如见大量典型的葡萄球菌可初步诊断。

2.分离培养：无污染时，将病料划线接种于普通琼脂或血琼脂平板，37℃培养24～h，挑选可疑菌落进行纯培养。血液、呕吐物、粪便等病料，可先接种肉汤进行增菌培养再划线接种高盐甘露醇培养基、卵黄高盐甘露醇培养基或Baird-Parker培养基（含丙酮酸钠、氯化锂）等选择性培养基，然后再进行纯培养。

得到的纯培养物需要进一步鉴定，金黄色葡萄球菌具备如下特征：革兰阳性球菌；触酶阳性；血浆凝固酶阳性；耐热核酸酶阳性。另外，致病菌株可表现为溶血、分解甘露醇产酸。

但上述实验不能作为鉴别其产毒与否的依据。

3.葡萄球菌肠毒素的检查：将呕吐物、粪便或剩余食物作细菌分离鉴定的同时，接种至肉汤培养基，置20％～30％CO₂培养h，离心沉淀后取上清液，经100℃min处理后注射至6～8周龄的幼猫静脉或腹腔。若在注射后min至h出现寒战、呕吐、腹泻等急性胃肠炎症状，表明有肠毒素存在。经ELISA方法可快速检测微量肠毒素，PCR可检测葡萄球菌肠毒素基因，应用DNA探针杂交技术则可直接检出产肠毒素的阳性菌株。

（四）防控

青霉素类药物是防治葡萄球菌病的首选药物，但易形成耐药性，必要时可通过药敏试验筛选敏感药物。

【知识链接】

超级细菌MRSA：超级细菌是指一类几乎对所有抗生素都强劲耐药的细菌。目前世界各国相继分离到了各种超级细菌，超级细菌的蔓延引起了世界各国的恐慌。在各类超级细菌中，最重要的为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin- resistant Staphylococcus aureus, MRSA）。

甲氧西林是一种耐青霉素酶的β-内酰胺类抗生素，自1959年应用于临床后，曾有效地控制了对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌的感染，仅时隔两年，英国首次报告了由MRSA引起的感染，20世纪80年代后期MRSA成为全球性的病原微生物，排在院内感染病原菌的首位。

MRSA除对甲氧西林耐药外，对其他β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药。MRSA还通过改变抗生素作用靶位、产生修饰酶、降低膜通透性、产生大量对氨基苯甲酸等不同机制，对大环内酯类、四环素类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类、红霉素类产生耐药。

由于MRSA对多种抗菌药物具有广泛耐药性，其感染后的治疗问题已成为当前临床上的难题，万古霉素等糖肽类抗菌药物成为治疗MRSA感染的首选药。但随着万古霉素的广泛使用，某些MRSA菌株进一步突变后，出现了万古霉素中介株和万古霉素耐药株。

目前MRSA感染、乙型肝炎和获得性免疫缺陷综合征被列为世界范围内三大最难解决的感染性疾病。2007年10月美国政府报道，一年内，美国有近1.9万人因为感染了MRSA而死去。欧洲食品安全局在对欧洲MRSA的流行情况进行调查时发现，荷兰、德国、加拿大和美国等国的生猪以及猪场的工人和兽医中检测到了高水平的MRSA流行性。在感染动物中，猪、鸡、牛、犬、马均有感染MRSA的报道，以猪和牛感染最多，牛奶、鸡肉及屠宰场环境中也均分离到该菌。MRSA在接触动物频率高的人群中携带率高，因此MRSA成为全球重要的公共卫生问题。

二、链球菌（Streptococcus）

链球菌属种类很多，在自然界分布很广，水、尘埃、人和动物的体表、上呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等都有存在，有些是非致病菌，有些构成人和动物的正常菌群，有些可引起各种化脓性疾病、肺炎、乳腺炎、败血症等。

（一）生物学特性

1.形态与结构：链球菌呈球形或卵形，直径为0.6～1.um，常呈链状排列，链的长短与菌种和生长环境有关，从4～8个至20～30个菌细胞组成不等，液体培养易形成长链，而在固体培养基上常呈短链。大多数链球菌在幼龄培养物中可见到荚膜，继续培养则荚膜消失。无芽胞和鞭毛。革兰染色阳性。

图15-2　链球菌的血涂片

2.培养特性：大多数为兼性厌氧，少数为厌氧菌。致病菌营养要求较高，普通培养基中生长不良，在加有血液、血清、葡萄糖等的培养基中生长良好。在血琼脂平板上形成直径0.1～1.mm、灰白色、表面光滑、边缘整齐的小菌落。多数致病菌株具有溶血能力，根据其在血琼脂平板上的溶血现象可分为甲型（α）、乙型（β）、丙型（γ）3类。在血清肉汤中生长，初呈均匀混浊，后因细菌形成长链沉于管底，上清透明。

本属细菌都能发酵葡萄糖、蔗糖，对其他糖的利用能力则因不同菌种而异。

链球菌触酶反应阴性，以此可与葡萄球菌进行区别。

3.抗原结构：链球菌的抗原结构复杂，主要有群特异性抗原、型特异性抗原和属特异性抗原。

群特异性抗原又称C抗原，是存在于链球菌细胞壁中的多糖成分。根据该抗原不同，将链球菌分为20个群，用大写英文字母表示，有A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U、V共20个血清群。

型特异性抗原位于C抗原的外层，为蛋白质成分。据此可将链球菌分为M、T、R、S、G等5种。M抗原与链球菌的毒力密切相关。

属特异性抗原又称核蛋白抗原，与葡萄球菌有交叉。

4.抵抗力：本菌抵抗力不强，60℃min即被杀死。常用浓度的各种消毒药均可杀死本菌。乙型溶血性链球菌对青霉素、磺胺类药物敏感。

（二）致病性

致病性链球菌可产生多种毒素或酶，如透明质酸酶、溶纤维蛋白酶（链激酶）、脱氧核糖核酸酶等酶类以及链球菌溶血素、致热外毒素、杀白细胞素等毒素。

不同血清群的链球菌所致疾病也不同。A群链球菌常引起人的猩红热、脓肿、风湿等，B群及C群的某些链球菌可引起奶牛乳房炎，C、D、E群的某些链球菌还可引起猪的急性或亚急性败血症、脑膜炎、关节炎及肺炎等。

（三）微生物学诊断

根据不同的病型采集相应的病料，如脓汁、渗出液、乳汁、血液、组织脏器等。

1.涂片镜检：发现革兰阳性、成双或链状排列的球菌，可初步诊断。在链球菌败血症羊、猪等动物组织涂片中，往往呈双球状，有荚膜，在腹腔或心包液等组织液中常呈长链状排列，但荚膜不如组织中明显。

2.分离培养：将病料接种于血琼脂培养基上，对得到的纯培养物进行鉴定。如果符合革兰阳性球菌且呈链状排列、触酶阴性即可确定为链球菌。再根据本菌在血平板上的溶血表现，可确定为α、β或γ溶血性链球菌。

PCR方法可用于临床大样本的流行病学调查。

如果需要进一步对分离的链球菌进行分群或定型，可用链球菌群特异性血清或型特异性血清进行鉴定。

（四）防控

对发生猪链球菌病的地区，可用疫苗进行预防注射。对感染家畜应及早应用抗生素或磺胺类药物进行治疗。

【知识链接】

微生物溶血（彩图10）：

α溶血：细菌在血平板上培养时，菌落周围形成的狭小（1～mm）、草绿色溶血环。α溶血环中的红细胞未完全溶解，故α溶血也称为不完全溶血。可形成α溶血环的细菌如甲型溶血性链球菌、肺炎链球菌。

β溶血：细菌在血平板上培养时，菌落周围形成宽大（2～mm）、界限分明、完全透明的溶血环。β溶血环中的红细胞完全溶解，故β溶血也称为完全溶血。可形成β溶血环的细菌如乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等。

γ溶血：即不溶血。

三、李氏杆菌（Listeria）

李氏杆菌属的细菌在自然界分布广泛，可从土壤、腐烂植物、青贮饲料、淡水、人畜粪便及损伤组织中分离到。本菌为革兰阳性、无芽胞、无荚膜的小杆菌。以本属代表种产单核细胞李氏杆菌（Listeria monocytogenes）为例介绍本属细菌。

（一）生物学特性

1.形态与结构：本菌为革兰阳性无荚膜、无芽胞的短杆菌。形态规则，大小为（0.4～0.5）um×（0.5～2.0）um，在抹片中或单个分散，或两个菌排成V形或互相并列（图15-3）。在陈旧的培养物中菌体可形成长丝状。在20℃～25℃时培养可产生4根周鞭毛，37℃时鞭毛数量减少或无鞭毛。无抗酸染色特性。该菌为胞内寄生菌，常在感染动物的白细胞中可见。

图15-3　李氏杆菌

2.培养特性：需氧或兼性厌氧。生长温度范围广（1℃～45℃），最适温度为30℃～37℃。在4℃缓慢生长，据此特征可对污染或含菌数较少的样品进行冷增菌。普通培养基上可生长，但在血清或全血琼脂培养基上生长良好，形成透明、蓝灰色、光滑型菌落，移去菌落可见狭窄的β溶血环，此特征可与猪丹毒丝菌及棒状杆菌相区别。

触酶阳性，据此可与猪丹毒丝菌相区别，但棒状杆菌反应也为阳性。本菌可分解葡萄糖、鼠李糖、麦芽糖等，MR及V-P实验均为阳性。氧化酶阴性。

3.抗原结构：产单核细胞李氏杆菌具有O抗原及H抗原，本菌与葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌及多数革兰阳性菌之间存在某些共同抗原，故血清学诊断意义不大。

4.抵抗力：本菌对外界抵抗力较强。抗干燥，在干粪中能存活两年以上。耐盐耐碱，在含10％氯化钠的培养基中能生长，在20％氯化钠溶液内能经久不死，至pH9.6仍能生长。对湿热敏感。一般消毒药都易使之灭活。对氨苄西林敏感，对磺胺类药物、多黏菌素有抵抗力。

（二）致病性

本菌为胞内寄生菌，能侵袭肠黏膜上皮细胞及肝、脾巨噬细胞并在其中定殖，还可以通过损伤的黏膜经神经末梢的鞘膜进犯中枢神经系统。产单核细胞李氏杆菌可产生溶血素、磷脂酶、内化素和肌动蛋白聚合蛋白，帮助细菌在胞内寄生并在宿主细胞间扩散。

在自然条件下，本菌可使人及多种动物发病，绵羊、猪、家兔感染的报道较多，牛、山羊次之。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，成年牛羊往往表现为神经症状的“转圈病”；可致孕畜流产。人群中主要感染新生儿、孕妇、免疫功能缺陷者。健康动物往往带菌并经粪便排菌，污染环境。李氏杆菌为重要的食源性致病菌，在公共卫生学上备受关注。

（三）微生物学诊断

采集气管分泌物、盲肠内容物、病变组织等。

1.分离培养：将气管分泌物及病变组织接种血琼脂平板，37℃培养24～h；将回盲肠内容物1∶10稀释后接种LB1增菌液，30℃培养18～h再接种LB2增菌液进行相同温度及时间的二次增菌（LB增菌液中的萘啶酮酸和吖啶黄为选择性抑菌剂）；取一环LB2增菌液划线接种李氏杆菌选择性培养基MMA（内含的甘氨酸、氯化锂、苯乙醇和复达欣可抑制非李氏杆菌以外的部分革兰阳性菌和革兰阴性菌），30℃培养48h。

2.鉴定：在血平板上形成圆形、光滑湿润并有狭窄透明的β溶血环的小菌落；在MMA平板上形成的菌落用斜射光照射镜检时呈蓝灰色或蓝色、圆形稍突起、边缘整齐的小菌落。

挑取菌落进行涂片染色镜检，革兰阳性小杆菌、或单在、或成双排列或呈“V”形排列。

接种三糖铁琼脂30℃培养h，斜面产酸、底层产酸、不产H₂S；接种SIM动力培养基，25℃培养2～d，有动力，伞状或月牙状生长。

进行生化实验，如硝酸盐（－）、甘露醇（－）、鼠李糖（＋）、木糖（－）、MR（＋）、V-P（＋）、尿素（－）、七叶苷（－），则报告产单核细胞李氏杆菌阳性。

（四）防控

预防李氏杆菌病的关键在于控制该菌的污染，避免用受污染的青贮饲料投喂家畜。患病初期可用抗生素治疗，如青霉素、氨苄西林、庆大霉素及红霉素等。

四、炭疽杆菌（Bacillus anthracis）

炭疽杆菌可经多种途径感染人类、家畜和野生动物，发生炭疽病。炭疽杆菌是国际上公认的生物武器，在兽医学和医学上均占有相当重要的地位。

（一）生物学特性

1.形态与结构：炭疽杆菌为革兰阳性粗大杆菌，大小为（1.0～1.2）um×（3～5）um，两端平截，排列似竹节状，无鞭毛，不能运动。本菌在氧气充足、温度适宜（25℃～30℃）的条件下易形成芽胞（图15-4）。在活体或未经解剖的尸体内，则不能形成芽胞。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央，其宽度小于菌体的宽度；在机体内或含有血清的培养基上形成荚膜。有荚膜的炭疽杆菌毒性强。当菌体因腐败而消失后，荚膜仍可残留，称为“菌影”。

图15-4　炭疽杆菌的革兰染色片（左图：纯培养右图：组织涂片）

2.培养特性：本菌为需氧或兼性厌氧菌。在普通培养基中易繁殖，最适温度为37℃。在普通琼脂平板培养h，长成灰白色、干燥的菌落，边缘呈卷发状。在血液琼脂平板上不出现溶血现象。在普通肉汤培养18～h，管底有絮状沉淀生长，无菌膜，菌液清亮；明胶穿刺培养呈倒立松树状生长，其表面逐渐被液化呈漏斗状。

在含有青霉素0.U/mL的培养基中，幼龄炭疽杆菌细胞壁的肽聚糖合成受到抑制，形成原生质体相互连接成串的现象，称为“串珠反应”。当青霉素含量达U/mL时，则完全不生长或轻微生长。该特性为炭疽杆菌所特有，可与其他需氧芽胞杆菌相鉴别。

3.抗原结构：炭疽杆菌有荚膜抗原、菌体抗原、保护性抗原和芽胞抗原等4种主要抗原成分。

（1）荚膜抗原：仅见于有毒菌株，与毒力有关，是一种半抗原。针对该抗原的抗体没有保护作用，但其反应较特异，可用于建立各种血清学鉴定方法。

（2）菌体抗原：是存在于细胞壁及菌体内的一种半抗原，与细菌毒力无关。经加热或腐败等仍可保留抗原性，故常用Ascoli反应检测动物皮毛中的炭疽杆菌抗原，但该抗原能与其他需氧芽胞杆菌发生交叉反应。

（3）保护性抗原：是炭疽杆菌代谢过程中产生的一种胞外蛋白质抗原成分，在人工培养条件下亦可产生，为炭疽毒素的组成成分之一，具有免疫原性，能使机体产生保护力。

（4）芽胞抗原：是芽胞的外膜层含有的抗原，具有免疫原性和血清学诊断价值。

4.抵抗力：本菌繁殖体抵抗力不强，易被一般消毒剂杀灭，而芽胞抵抗力强，在干燥的室温环境中可存活数十年，在皮毛中可存活数年。牧场一旦被污染，传染性可保持20～30年。湿热121.3℃min或干热160℃h可将芽胞杀死。炭疽芽胞对碘特别敏感，对青霉素、先锋霉素、链霉素、卡那霉素等高度敏感。

（二）致病性

炭疽杆菌的毒性主要与荚膜的形成和炭疽毒素的产生有关。荚膜具抗吞噬作用，有利于细菌在宿主组织内繁殖扩散。炭疽毒素是造成感染者致病和死亡的主要原因，直接损伤微血管内皮细胞，增加血管通透性而形成水肿，微循环障碍致感染性休克甚至死亡。

炭疽杆菌可引起草食动物（牛、羊、马等）发生炭疽病。人因接触患病动物或受染皮毛而引起皮肤炭疽，食入未煮熟的病畜肉类、奶或被污染食物引起肠炭疽，或吸入含有大量病菌芽胞的尘埃可发生肺炭疽。上述三型均可并发败血症，偶见引起炭疽性脑膜炎，死亡率极高。

（三）微生物学诊断

疑似炭疽死亡动物的尸体，应尽快自末梢血管（耳尖、尾尖等）采血，涂片染色镜检，取血后应立即用烙铁将创口烙焦，以止血封口。由于炭疽杆菌暴露于空气中容易形成芽胞，所以对疑似炭疽尸体严禁剖检。

1.涂片镜检：取标本涂片进行革兰染色，发现有荚膜的呈竹节状排列的革兰阳性大杆菌，结合临床症状可作出初步诊断。陈旧病料可以看到“菌影”，确诊需做分离培养和动物接种。

2.分离培养：取病料接种普通琼脂或血液琼脂，37℃培养18～h，观察有无典型的炭疽杆菌菌落，同时革兰染色镜检。

3.动物试验：将待检病料加生理盐水磨匀，或将培养物用生理盐水做适当稀释，皮下注射小鼠0.1～0.mL，炭疽样品可在18～h致死小鼠。剖检可见注射部位皮下胶冻样水肿，脾脏肿大。取脏器涂片镜检，如发现有荚膜竹节状大杆菌，即可确诊。

4.血清学试验：常用炭疽环状沉淀试验（Ascoli氏反应）检测各种病料、甚至严重腐败污染的尸体材料、动物皮毛有无炭疽杆菌抗原，但反应特异性不高，敏感性也较差。

（四）防控

炭疽的预防重点应放在家畜感染的防控和牧场的卫生防护上。病畜应严格隔离或处死深埋，杜绝在无防护条件下现场剖检取材，严禁对死畜剥皮或煮食，尸体应焚毁或深埋于地表m以下。对易感家畜进行预防接种是防控该病的有效措施。常用无毒炭疽芽胞苗和Ⅱ号炭疽芽胞苗对动物进行免疫。治疗炭疽，可采用抗炭疽血清、抗生素及磺胺类药物的综合疗法。

五、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）

产气荚膜梭菌旧称魏氏梭菌，在自然界分布极广，土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜肠道等都有存在，在一定条件下可引起多种严重疾病。

（一）生物学特性

1.形态与结构：产气荚膜梭菌为两端钝圆的革兰阳性粗大杆菌，大小为（0.6～2.4）um×（1.3～19.0）um，单在或成双。无鞭毛，不运动。本菌虽能形成芽胞，但在动物组织和一般培养物中，很少能看到芽胞。在产芽胞培养基上，可形成大而圆的偏端芽胞，使菌体膨胀。多数菌株可形成荚膜。

2.培养特性：本菌对厌氧要求并不严格，在普通平板上形成灰白色、不透明、表面光滑、边缘整齐的菌落。有些菌株形成“勋章”样的菌落（图15-5），中间突起，外周有放射状条纹。在血琼脂平板上，多数菌株有双层溶血环，内环透明，外环淡绿（彩图11）。在牛乳培养基中，能分解乳糖产酸并使酪蛋白凝固，产生的大量气体冲开凝固的酪蛋白，出现“暴烈发酵”，是本菌的特点之一。

图15-5　产气荚膜梭菌的勋章样菌落

3.抗原结构：产气荚膜梭菌具有菌体抗原和外毒素两类抗原物质。菌体抗原具有较强的交叉反应性，不能用菌体凝集反应对产气荚膜梭菌进行分型。根据产生外毒素的不同，可将本菌分成A、B、C、D、E共5型。

4.抵抗力：本菌在90℃min或100℃min可死亡，而食物中毒型菌株可耐煮沸1～h。

（二）致病性

产气荚膜梭菌由消化道或伤口侵入机体，产生多种毒素和酶。产气荚膜梭菌产生的外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、τ、κ、λ、u、ν等12种，也能产生具有毒性作用的多种酶，如卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶等，构成强大的侵袭力。在各种毒素和酶中，以α毒素最为重要，为一种卵磷脂酶，能损伤多种细胞的细胞膜，引起溶血、组织坏死，血管内皮细胞损伤，使血管通透性增高，造成水肿。产气荚膜梭菌能引起人畜多种疾病，A型菌主要引起人气性坏疽和食物中毒，B型菌主要引起羔羊痢疾，C型菌主要引起绵羊猝疽，D型菌引起羔羊、绵羊、山羊、牛的肠毒血症，E型菌可致犊牛、羔羊肠毒血症，但很少发生。

（三）微生物学诊断

A型菌所致人气性坏疽和食物中毒的微生物学诊断，主要依靠细菌分离鉴定。其余各型所致的疾病，均由细菌在肠道产生毒素所致，正常人畜肠道中常有该菌存在，因此，从病料中检出产气荚膜梭菌并不能说明它就是病原，只有分离到毒力强的产气荚膜梭菌时，才具有一定参考价值。

1.涂片镜检：取肠黏膜触片染色，如见大量的革兰阳性大杆菌、多单在或两个相连、有荚膜，则怀疑为本菌。产气荚膜梭菌虽能形成芽胞，但触片及培养物中均不易观察到。

2.分离培养：取病料接种厌氧肉肝汤，37℃3～h即可旺盛生长，并产生大量气体。接种血平板厌氧培养18～h，形成凸起、半透明、表面光滑、边缘整齐的大菌落，菌落周围有溶血环或双层溶血环。培养一段时间后，可见“勋章样”菌落。

将纯培养接种含铁牛乳培养基中，于46℃h厌氧培养，该菌可引起“暴烈发酵”；将纯培养接种10％卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养h，该菌因产生卵磷脂酶可在菌落底部及周围产生乳白色浑浊带。

将细菌的液体培养物接种鸽胸肌，过夜后鸽子死亡，从其胸肌接种部位可涂片镜检到有荚膜的菌体。

以上检测可确定分离到产气荚膜梭菌。

3.肠内容物毒素检测：取回肠内容物，如采集量不够，可再采空肠后段或结肠前段内容物，加适量灭菌生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份不加热、一份加热（60℃min）。分别静脉注射家兔（1～mL）或小鼠（0.1～0.mL）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至十几小时内死亡，而加热组动物不死亡。

为确定致死动物的毒素类别及细菌的型别，须进一步做毒素中和保护试验。

六、分支杆菌（Mycobacterium）

分支杆菌在自然界分布广泛，少数是人和动物的病原菌，对动物危害较重的是结核分支杆菌（引起灵长类动物结核病）、牛分支杆菌（引起其他哺乳动物结核病）、禽分支杆菌（主要引起禽结核）和禽分支杆菌副结核亚种（引起副结核病）。牛分支杆菌、结核分支杆菌和禽分支杆菌均为动物结核病的病原，具有许多相似特性，这里一并介绍。

（一）生物学特性

1.形态及结构：分支杆菌大小为（0.2～0.6）um×（1.0～10）um。结核分支杆菌为细长、直或稍弯的杆菌，单在、少数成丛，牛分支杆菌菌体短而粗，禽分支杆菌最短，呈多形性。在陈旧的培养基或干酪性病灶内的菌体可见分支现象。革兰染色阳性，但不易着色；经齐尼二氏抗酸染色后，本菌可抵抗3％盐酸酒精的脱色而染为红色，背景及其他非抗酸菌为蓝色，故称该菌为抗酸性细菌（彩图12）。

2.培养特性：本菌为严格需氧菌，营养要求较高，最适温度为37℃～37.5℃，禽分支杆菌可在42℃生长。常用罗杰二氏培养基（内含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐及孔雀绿等）培养，结核分支杆菌14～h分裂一次，菌落形成较慢，一般需10～d才能看到黄色菌落，显著隆起，表面粗糙皱缩坚硬，不易破碎，类似菜花状（图15-6）；在液体培养基中，其表面形成厚皱菌膜，培养液一般保持清亮。

3.抵抗力：本菌细胞壁因含丰富的脂类而表现较强的抵抗力。对干燥、寒冷具有较强的抵抗力，但对湿热的抵抗力弱，62℃～63℃min失去活力。对紫外线敏感。常用消毒剂需h才能杀灭该菌，但在70％乙醇及10％漂白粉中迅速死亡，碘化物的消毒作用很明显，但无机酸、有机酸、碱性和季胺盐类消毒剂不能有效杀灭本菌。

本菌对链霉素、异烟肼、对氨基水杨酸和环丝氨酸等药物敏感，而对常用的磺胺类、青霉素及其他广谱抗生素均不敏感。

图15-6　结核杆菌形成的菜花样菌落

（二）致病性

本菌的致病过程是以细胞内寄生和形成局部感染病灶为特点。细菌胞壁富含糖脂，可保护本菌免受吞噬细胞内溶酶体的破坏。本菌不产生毒素。牛分支杆菌和人结核分支杆菌毒力较强，禽分支杆菌则较弱。牛分支杆菌主要引起牛结核病，其他家畜、野生反刍动物、人、灵长类动物、犬、猫等肉食动物均可感染。禽分支杆菌主要引起禽结核，也可引起猪的局限性病灶。结核分支杆菌可使人、畜禽及野生动物发生结核病，山羊和家禽对结核分支杆菌不敏感。

（三）微生物学诊断

1.细菌学诊断：将病料结节切开，制成薄的涂片。乳汁以000～r/min离心min，分别取脂肪层和沉淀层涂片。涂片干燥固定后经抗酸染色，如发现红色成丛杆菌时，可作出初步诊断。必要时进行细菌的分离培养和动物试验。

2.变态反应诊断：本法是临床结核病检疫的主要方法。目前所用的诊断液为提纯结核菌素（PPD），诊断方法为皮内试验。按照我国《动物检疫操作规程》规定，牛颈部皮内注射0.mL（10×10⁴U/mL）h后局部炎症反应明显，皮肤肿胀厚度差≥mm为阳性；如局部炎症不明显，肿胀厚度差在2～mm间为疑似；如无炎症反应，皮肤肿胀厚度差在mm以下，为阴性。凡判为疑似反应牛，d后需复检一次，如仍为疑似，经30～d再次复检，如仍为疑似则判为阳性。

（四）防控

结核病的免疫是带菌免疫，当结核杆菌从机体消失或死亡后，机体的免疫也终止了。人类广泛采用卡介苗免疫接种，免疫期达4～5年。接种卡介苗的牛在一年后仍维持变态反应阳性，在用结核菌素检疫时无法与自然感染的牛区别，因而牛场不宜推广此法。按规定，饲养牛群不接种卡介苗，每年春、秋需进行检疫，结核菌素变态反应检测阳性者，要隔离饲养。鉴于抗体产生与结核病的正相关性，在检疫时如能将变态反应与ELISA结合进行，可提高检出率。对检出的患病动物要扑杀处理。特别贵重的动物可用链霉素、异烟肼、对氨基水杨酸和环丝氨酸等药物治疗。