第三节 细菌的鉴定
通过分离培养获得的病原菌，必须达到不含有其他微生物的纯培养程度，才能进行系统鉴定。系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生长特性、生理生化特性、抗原性和病原性大小等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型。微生物鉴定的程序通常是根据其形态，生长、生化特性等定种，最后根据抗原的免疫血清学检查定型。
一、细菌形态学检查
各种细菌的形态，在适宜的环境下是相对稳定的。但环境的改变，如培养基条件的改变，抗生素和化学药品的作用等，均可使细菌产生不规则的形态，并可出现细胞壁的缺陷和多样性。为此，在作细菌形态鉴定时，必须按被检菌的生长要求，选择适宜的培养基和培养条件，以及适宜的培养时间和检查方法，才能作出正确的形态学鉴定。形态学检查一般包括两方面：肉眼观察和显微镜检查。
（一）肉眼观察
主要观察细菌在固体、液体、半固体及鉴别培养基上的生长情况。
1.在固体培养基上要观察菌落大小、形态、颜色是否均匀一致，表面是光滑湿润，还是干燥无光或呈皱纹状，边缘是否整齐，菌落是隆起、扁平，还是乳头样，是透明、半透明或不透明。
2.在半固体培养基上应观察细菌是否沿着接种线生长，是呈毛刷样生长还是均匀生长，上下生长是否一致。
3.在液体培养基中，要观察培养基是否呈均匀混浊，管底有无沉淀，液面有无菌膜，是否产气等。
4.在鉴别培养基上，应观察其生长情况是否与预期的相一致。
5.在血琼脂培养基上还要观察是否溶血及溶血圈的特点。
6.在某些培养基上还要注意一些其他特性，如是否有臭味等。
（二）显微镜观察
在做细菌个体形态学检查时，要根据被检菌的种类和检查项目，注意选择合适的培养基以及恰当的培养细菌的时间，并选用相应的染色方法，才能达到预期的目的。一般以18～24h（生长时间长的细菌除外）的幼嫩培养菌为宜。例如，作革兰氏染色检查时，培养时间长的陈旧细菌，可能由阳性变为阴性。作细菌运动性检查时，液体培养基的幼嫩培养物（几小时到十几小时）最为适宜。作炭疽荚膜染色时。因炭疽杆菌在一般培养基上不形成荚膜，而在动物体内形成明显的荚膜，因此，应先接种小鼠，取死亡动物的病料作涂片标本镜检。作鞭毛染色时，以液体培养基为宜。芽孢的形成，因细菌种类不同，往往对培养条件如培养基、空气和培养时间等而异，但一般均要求较长时间。镜检时除注意其基本形态结构和大小（要用测微计测量）外，还应注意其排列状态、菌端形状、有无两极染色、有无形成芽孢和荚膜等。必要时可用电镜观察其微细结构。
1.细菌的形态
细菌基本形态及构造的观察，常以染色标本片在光学显微镜下进行观察。
（1）球菌：呈正圆形或近似圆形，有的呈卵圆形。球菌按其分裂后的排列方式不同可分为五个类型：①双球菌：常成双排列。②链球菌：呈链状排列，链的长短不一。③四联球菌：四个联结成方形排列。④八叠球菌：八个堆叠一起，呈立体方形排列。⑤葡萄球菌：无一定次序，无一定数目，不规则地堆在一起，呈葡萄状。
（2）杆菌：杆菌的形态多种多样，有的笔直、两端钝圆或平齐，有的稍弯曲。各种杆菌长短粗细差异很大，按其形态排列可分为三种：①单杆菌：菌体单个存在。②双杆菌：两菌一端相连，排列成对。③链杆菌：多菌相连，呈链状。
3.螺旋状菌：菌体呈弯曲状。按其曲度和螺旋次数又分为弧菌和螺菌。前者菌体的弯曲度不超过圆形的1/4。①弧菌：菌体只有一个弯曲，呈弧形。②螺菌：菌体有两个以上弯曲，呈螺旋形。
2.细菌的一些构造
（1）荚膜：普通染色只能见到荚膜位于菌体周围，呈未着色的透明圈；用特殊染色法可将荚膜与菌体染成不同的颜色。
（2）鞭毛：为细长而弯曲的丝状物，长度常超过菌体若干倍，但很细，需经特殊染色法或电镜下才可观察到。鞭毛的位置和数目也因细菌的种类而异：单毛菌菌体化一端形成一根鞭毛；丛毛菌菌体在菌体一端形成一束鞭毛；周毛菌在菌体周围形成或多或少的鞭毛。
（3）芽孢：呈圆形或卵圆形，其大小及在菌体的位置随菌体而异：中央芽孢的孢体比菌体小，位置在菌体中央；偏端芽孢的孢体靠近菌体的顶端；顶端芽孢的孢体位于菌体的顶端，形如鼓槌。普通染色法不能使芽孢着色，需用特殊的芽孢染色法染色。
（4）染颗粒：一般呈球形，是细菌细胞浆中酸性小颗粒。美蓝染色时异染颗粒呈红色，而菌体其他部分呈蓝色。
（三）细菌的染色过程
1.细菌抹片的制备
（1）玻片准备：载玻片应清晰透明、洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：①滴上95%酒精2～3滴，用洁净纱布擦拭，然后在洒精灯上轻轻拖过几次。②若上法仍未能去除油渍，可再滴上1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻通过。
（2）抹片：依所用材料情况不同，抹片方法也有差异。
①组织脏器抹片的制作。用镊子夹持脏器局部，以灭菌或洁净的剪刀剪取一小块，将其新鲜切面在载玻片中部表面轻轻压印或轻而迅速涂抹。
②血片的制作。取载玻片一张，将血液一小滴（米粒大小）滴于载玻片的一端，左手拇指与中指持载玻片的两端，右手持推片（选用边缘光滑平整的载玻片）与血滴接触后，轻微向左右移动，使血滴沾附推片与载玻片之间，形成30°～40°角，向前推进涂抹，使之涂成薄薄的一层血膜。如蘸取的血液过多，必须将推片提前，在血滴的前方再接触载玻片，等血液扩散后再向前推进涂抹。涂抹时推片与载片之间角度要适当，推进速度适中，用力均匀，并要一推到底，中间不能停顿。血膜的长度最好不短于载玻片的1/3，载玻片的两侧应留有空隙。良好的血片必须薄而匀，对光观察有荧光。
（3）培养物抹片的制作
①固体培养物抹片的制作。用灭菌的接种环取一滴生理盐水置载玻片中央，然后以左手持培养瓶或试管，瓶底（管底）握于手中，右手拇指、食指、中指执接种环柄，将接种环在酒精灯火焰中烧灼灭菌，以右手小指和无名指扭开瓶盖或管塞，棉塞头向掌心内，将瓶口（管口）通过酒精灯火焰灭菌，然后将烧灼的接种环放在管口冷却一下再蘸取培养物少许，同样将管口通过火焰灭菌后，塞好塞子，放于架上。最后将接种环上的培养物置载玻片上的生理盐水中混匀，涂成小手指大、厚薄适宜的抹面，接种环进行烧灼灭菌。
②液体培养物抹片的制作。用灭菌冷却的接种环取液体培养物1～2环置载玻片中央，然后涂成小手指大、厚薄适宜的抹片即可。
2.干操
上述抹片，应让其自然干燥。
3.固定
有两类固定方法：①火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。②化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min后，自然挥发干燥。抹片如作瑞氏染色，则不必固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。
4.染色
固定好的抹片，可以根据需要进行各种染色。
5.镜检
将显微镜置于平坦、稳固的显微镜台上，装上玻片后，先用低倍镜观察，找到观察对象后将其移至视野的中央，然后换用高倍镜观察即可，必须使用油镜观察时，应防止压碎玻片。
（四）常用的几种染色方法
细菌染色方法很多，主要分为单染色法、复染色法和特殊染色法3种。单染色法是用一种染料将细菌及周围的物体染成一种颜色，如碱性美蓝染色法。复染法（鉴别染色法）是用两种以上的染料染色，可将不同细菌染成不同的颜色，除可观察细菌形态外，还能鉴别细菌，如革兰氏染色法和抗酸染色法。特殊染色法就是采用着色力强的染色剂、脱色剂、加热、加酸、加矾等显示细菌芽孢、鞭毛、荚膜等特殊结构的方法，如细菌芽孢染色法等。
（五）染色液的配制及染色方法
1.革兰（Gram）氏染色法
（1）原理：有些细菌的胞浆膜中含有大的高分子核糖核酸镁盐，它在稀释碘液的作用下，可与结晶紫等碱性染料结合成稳定的，不易被酒精脱掉的紫色化合物，当用复红或沙黄等复染时，即不再着色，因此，这类细菌被染成紫色，称为革兰氏阳性细菌。另外，还有一种细菌的胞浆膜中由于没有高分子核糖核酸镁盐，虽然也能被结晶紫等碱性染料染上颜色，但不稳定，易被酒精脱掉，当用复红或沙黄等复染时，则又可被染成红色，称为革兰氏阴性细菌。
（2）染色液的配制
①草酸铵结晶紫染液
混合溶液A和溶液B，静置48h后使用。
②革兰或鲁格尔（Lug01）氏碘液
先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分。
③95%的酒精溶液：直接用95%酒精，或95ml纯酒精加5ml蒸馏水混匀即可。
④沙黄复染液：
取上述配好的沙黄酒精溶液10ml与80ml蒸馏水混匀即成。
（3）染色法：①涂片、自然干燥、火焰固定。
②滴加草酸铵结晶紫液染1～2min，水洗。
③滴加碘溶液1～3min，水洗。
④滴加95%酒精脱色20～30s（直到不脱色为止），水洗。
⑤加石炭酸复红液或沙黄液复染0.5～1min，水洗。
⑥吸干或自然干燥，镜检。
结果：革兰氏阳性菌为紫色，革兰氏阴性菌为红色。
2.碱性美蓝染色法
（1）染色液的配制
将配制的溶液A和B混合，滤纸过滤后备用，此液可长期保存。如欲获得多色性美蓝液，可将配好的美蓝液倾入大瓶中，松松地加以棉塞，每天振荡5min，时常以蒸馏水补足失去的水分，经过长时间（6～12个月）的保存，即可获得多色性。
（2）染色法：
①涂片、干燥、固定。
②滴加适量美蓝染液染色1～3min。
③水洗、干燥、镜检。
（3）结果：菌体呈蓝色。久存的美蓝具有多色性，能将菌体染成蓝色，荚膜染成红色，异染颗粒呈淡紫色，此法也是最简单的荚膜染色法。
3.碱性复红染色法
（1）染色液的配制
将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使其溶解，静置24h，过滤加水即成。
（2）染色法
①涂片、干燥、固定。
②滴加碱性复红染色液染1～3min，水洗、吸干、镜检。
（3）结果：菌体呈红色。
4.瑞特（Wright）氏染色法
（1）染色液的配制
①瑞特氏染液
将染料粉末置于干燥的乳钵内研磨，先加甘油，后加甲醇，溶解后装棕色瓶中，放暗处，经7d过滤，保存备用。
将上述药品溶于蒸馏水中即成。
染色法：此法适于染血片及组织片。
①涂片、自然干燥。
②滴加瑞特氏染液染1min，使标本被其中甲醇所固定。
③加等量pH6.4的磷酸盐缓冲液（若无磷酸盐缓冲液用蒸馏水代替亦可）轻轻晃动载玻片，混匀静置5min。
④水洗、吸干、镜检。
（3）结果：细菌被染成深蓝色。
5.姬姆萨（Giemsa）氏染色法
（1）染色液的配制:
先将姬姆萨染料粉末溶于甘油中，水浴加温55℃～60℃，经1～2h使充分溶解，再加入甲醇混匀，静置1d以上，滤过后置有色瓶中，临用时取上述配液1ml加蒸馏水10ml即成。
（2）染色法：
①缓慢染色法。对于一般不易着色的微生物如螺旋体等最为适用。
涂片、自然干燥；滴加甲醇2～3滴固定2～3min；将固定片浸于盛姬姆萨染色液的缸中染16～24h或过夜；水洗、干燥、镜检。
②快速染色法。本法适于血片、组织触片等的染色。
涂片、自然干燥；用甲醇固定1～3min；待干后，用姬姆萨氏原液1份加蒸馏水20份，新制成的混合液染色30～60min；再用蒸馏水充分冲洗约半分钟，自然干燥或吸干后，镜检。
（3）结果：细菌呈蓝青色，组织、细胞等呈其他颜色，视野常呈红色。
6.荚膜染色法
（1）美蓝染色法：抹片自然干燥，甲醇固定，以久储的多色性美蓝液作单染色，荚膜呈淡红色，菌体呈蓝色。
（2）瑞特氏或姬姆萨氏染色法：涂片自然干燥，以瑞特氏或姬姆萨氏染色液染色，荚膜呈淡紫红色，菌体呈蓝色。
（3）奥尔特（olt）氏荚膜染色法
①染色液的配制
取沙黄于乳钵研磨，徐徐加水溶解即成。
②染色法：涂片，自然干燥，加热固定；滴加3%沙黄染色液，并加热至产生蒸汽后，继续染3min；水洗、干燥、镜检。
③结果：菌体呈红褐色，荚膜呈黄色。
7.芽孢染色法：用复红美蓝芽孢染色法。
（1）染色液的配制
①石炭酸复红液
两液混合即成。
②95%的酒精。
③碱性美蓝液。配制见碱性美蓝染色法。
（2）染色法
①涂片、干燥、固定。
②滴加石炭酸复红溶液并加热使蒸汽出现5min，冷却后水洗。
③用95%酒精脱色2min，水洗。
④滴加碱性美蓝液复染1min，水洗、干燥、镜检。
（3）结果：菌体呈蓝色，芽孢呈红色。
8.鞭毛染色法
（1）莱佛逊（Leifson）氏鞭毛染色法
①染色液的配制
依上列次序将各液混合，置于紧塞玻瓶中，其保存期为7d。
②菌液制备：先将细菌接种在潮湿的平板上，培养6h，取爬行最前的细菌，接种到另一新平板上培养，反复3～4次，最后一次培养6～8h，轻轻刮取爬行前面的细菌，放在蒸馏水中，呈轻度混浊，然后，每毫升菌液中加0.1～0.2ml甲醛后制片；或用半固体培养基传代几次后，再接种到肉汤培养基中，取其生长表面的菌液直接制片。
③染色：按上述方法制成标本片后，加上莱佛逊氏鞭毛染色液，在25℃～37℃下，染色10～15min，水洗后干燥，镜检。
④结果：鞭毛、菌体均为红色。
（2）银染法
①染色液的配制
取鞣酸加蒸馏水，在50℃的水浴中混合溶解，备用。另外配制6%的三氯化铁溶液，临用前将两液等量混合。
将硝酸银溶于蒸馏水中。取出5～10ml作为回滴用，其余的硝酸银溶液用10% NH3OH滴至出现沉淀，继续滴加NH3OH，使沉淀消失。当溶液刚一澄清时，就用留下的硝酸银回滴，使其发生沉淀，再滴则沉淀消失，再滴则又有轻微而稳定的雾状沉淀为宜。
②菌液制备：同上。
③染色：取清洁无油的载玻片，加1～2环上述菌液，轻轻涂于载玻片表面，自然干燥后，置蒸馏水中浸泡1min，干燥后加A液数滴，0.5min后用蒸馏水冲洗，自然干燥后，加B液数滴，加温使产生蒸气，维持1min，蒸馏水洗，干燥后镜检。
④结果：菌体深褐色，鞭毛褐色。
（3）刘荣标氏鞭毛染色法
①染色液的配制
用时取A液10份和B液1份混合，此混合液能在冰箱中保存7个月以上。
②菌液制备：同上。
③染色：用上述方法制成标本片后，加上A、B混合液，室温中染色2～3min，水洗、镜检。
结果：菌体、鞭毛均呈紫色。
9.异染颗粒染色法
（1）美蓝染色法
①美蓝染色液：见碱性美蓝染色法的染液。
②染色法：涂片、干燥、固定；滴加多色性美蓝液染色30～60s，水洗、干燥、镜检。
③结果：异染颗粒呈淡红色，菌体为深蓝色。.
（2）奈瑟氏（Neisser）染色法
①染色液的配制
按上述次序溶解，混合过滤即成。
将蒸馏水加热至100℃，加入俾斯麦褐溶解，过滤待用。
②染色法：涂片、干燥、加热固定；滴加甲液染30～60s，水洗；滴加乙液染30s，水洗、干燥镜检。
③结果：异染颗粒呈深紫色，菌体为黄褐色。
10.抗酸染色法
（1）萋－尼（Ziehl－Neelsen）氏抗酸性染色法
①染色液的配制
取碱性复红、结晶石炭酸加入酒精中，于温水浴中进行溶解，然后加蒸馏水，使用前过滤。
二者混合摇匀即成。
0.5%美蓝水溶液：见碱性美蓝染色法。
②染色法：涂片、干燥、固定；滴加石炭酸复红液于涂片上，置载玻片于火焰上，加热微温至产生蒸气（不要沸腾），并保证染色5min（染色液蒸发减少时，应随时添加），冷却后用水冲洗；3%盐酸酒精脱色30～60s，水洗；0.5%美蓝液复染1min，水洗、干燥、镜检。
③结果：抗酸性细菌呈红色，其他菌或细胞呈蓝色。
（2）Pooman氏染色法
①染色液的配制：石炭酸复红液和l%美蓝酒精液的配制方法分别见石炭酸复红染色法及碱性美蓝染色法染液。
②染色法：涂片、干燥、固定；滴加石炭酸复红液染色1min，水洗、干燥；用1%美蓝酒精液复染20s，水洗、干燥、镜检。
③结果：与萋－尼氏抗酸性细菌染色法判定方法相同。
11.布氏杆菌鉴别染色法（科兹洛夫斯基氏染色法）
（1）染色液的配制
混合溶解，滤过即成。
混合溶解、滤过即成。
（2）染色法：涂片、干燥、火焰固定；滴加2%沙黄溶液，将载玻片置火焰上加热，微温至产生蒸气1～3min，冷却、水洗；滴加1%孔雀绿溶液染色1～2min，水洗、干燥、镜检。
（3）结果：布氏杆菌呈红色，其他细菌或细胞呈绿色。
12.螺旋体染色法（钩体镀银染色法）
（1）染色液的配制
混合即成。
现用时混合即成。
混合即成。
取A、B、C放在一个清洁干燥的100ml烧杯内溶解，另将D、E放在另一个烧杯内溶解，可略加温，然后将两杯溶液混合，使成乳状液，即可使用。此液装入黑色瓶内，外包以黑纸。经几天或稍长时间后，变为深黄色，便大部分失效，应另配新液。
（2）染色法
①涂片、干燥、滴加固定液1～2min，水洗；
②将载玻片放于60℃水锅的架上，加染色液染5min，弃去；
③加显影液，待出现黄色或棕色，水洗、干燥、镜检。
（3）结果：背景为黄色或棕色，螺旋体为黑色或褐灰色。
13.真菌染色法
（1）过碘酸锡夫氏染色法
①染色液的配制
甲液：1%过碘酸水溶液。
依上程序溶解即成。
混合溶解即成
混合即成。
②染色法：制片、干燥；加甲液染10min，水洗；加乙液染2～3min，倾去；加丙液染30～40min，至载玻片呈淡粉红色，水洗；加丁液染3min，充分水洗。
③结果：真菌组织染成鲜红色。
（2）乳酸酚棉蓝染色法
①染色液的配制
将前4种混合，加温溶解，再加棉蓝，摇匀即成。
②染色法：取洁净载玻片中央加染色液2滴；用接种针挑取培养物检样放于染色液中；左右手各持一接种针待将检样布匀，覆盖盖玻片，微加温后镜检。
③结果：真菌为蓝色。
14.马夏维洛（Maechiaveilo）染色法：此染色法用于立克次氏体、病毒包涵体的染色。
（1）染色液的配制
复红液：0.25%碱性复红水溶液，pH7.2～7.4，过滤即可。
柠檬酸液：0.5%柠檬酸水溶液。
美蓝液：1%美蓝水溶液。
（2）染色法
①涂片或触片加热固定。
②滴加复红液染色4min。
③用柠檬酸液迅速洗去染料，脱色数秒后，立刻用自来水冲洗。
④用美蓝染色15min。
⑤水洗、干燥、镜检。
（3）结果：立克次氏体呈红色，组织胞浆呈淡蓝色，细胞核呈深蓝色。
（六）细菌大小的测量
细菌的形体微小，要用光学显微镜放大几百倍到千倍左右才能看见，通常微米作为测量其大小的单位（1μm＝1/1000mm）。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也可因菌龄和环境因素的影响，其大小可有差别。一般球菌的平均直径为1.0μm左右，杆菌大小为2～8μm×0.5～1μm，螺旋菌大小为0.3～1μm×1～20μm。使用显微测微计来测量，以生长在适宜的温度和培养基中的幼龄培养物为标准，并以多个菌体的平均值或变化范围来表示。确定和比较细菌大小时，各因素、条件和技术操作等均应一致。
测量细菌大小的装置称为测微计，它由两部分组成，一是接目测微计，二是接物测微计。
接目测微计，为两个圆形玻片，中央部刻有50～100个等分小格，小格的长度不定，随接目镜与接物镜的放大倍数不同而异。因此，测量细菌大小之前，必须应用接物测微计来确定每一个小格的长度。使用时将接目测微计装入接目镜的中间部。
接物测微计，在载玻片的中央，有一圆形小玻片，在上面刻有100个小格，每一小格的长度为10μm，其全长为1mm。
测量时，首先固定镜筒的长度，然后在油镜下使接物测微计与接目测微计的小格重叠。借以求出接目测微计的一个小格的绝对值。例如，接目测微计的7个小格与接物测微计的一个小格重叠时，则接目测微计一个小格的值为7∶10＝l∶x，x＝10/7，x＝1.43，即1个小格为1.43μm。然后，取下接物测微计，放上欲测标本，检查标本上细菌的长或宽相当于接目测微计的几个小格，即为菌体的长或宽。
二、细菌的生化试验
细菌在含有一定化合物的培养基中生长后，由于细菌的分解与合成作用，可使该物质转化为其他物质。细菌产物的性质随细菌种类不同而异，可借助于生物化学方法测定出来，这种方法称为细菌的生化反应试验，又称生物化学特性检查法。
细菌的分解代谢和合成代谢受其本身的酶控制。若某一细菌含有某一种酶，该菌就可以把相应的物质转化为其他物质，而出现可见的反应。若无此酶，则无此反应。细菌的种类很多，它们所含有的酶也各不相同。因此，应用生物化学的方法来检测这些产物的性质，有助于对细菌的鉴别和鉴定。细菌的生化反应在种、型鉴别工作中具有重要价值，是继形态学鉴定之后的又一重要鉴别依据。可以用生化试验方法鉴定细菌，这是细菌鉴定的一个重要方面。下面介绍常用的生化试验方法。
（一）糖类代谢试验
1.糖发酵试验
（1）原理：细菌分解糖可产生有机酸或CO2和水，产酸可通过指示剂的颜色变化来检验，产气可见试管内倒立的小发酵管中蓄积的气体。如为半固体糖发酵，则可见到颜色改变和气泡在半固体中。
（2）培养基
①普通糖发酵培养基
取蛋白胨、氯化钠和水，混合加热熔解，调整pH为7.6，再加热10min。加入1.6%溴甲酚紫指示剂后，将上述的蛋白胨液分成若干份，如需要4种糖，就分成4份，分别加入各种糖。待糖溶解后，分装于有倒立发酵管的小试管内，每管液体要高于发酵管，如无发酵小管，可用半固体糖发酵培养基代替。加上塞，包装好，115℃蒸气灭菌20min，取出后即可应用。
②厌氧菌糖发酵培养基
除指示剂外，各成分加热熔解后，调整pH值为7.2～7.4，加入指示剂，分装试管，经115℃灭菌20min。
另外，厌氧菌的糖发酵试验亦可用普通糖发酵培养基，接种后应放在厌氧环境中培养。
③血清半固体糖发酵培养基
取肉膏汤100ml，加入琼脂，煮沸熔化后，加入糖及指示剂，115℃灭菌20min。待培养基冷至50℃，加入已经56℃30min灭活的兔血清10ml，分装于无菌试管，无菌检查后备用。
（3）试验方法：取18h～24h的试验菌接种于培养基中，置37℃培养1d～7d，多数细菌在24h即可观察结果。指示剂由紫色变为黄色，这表示糖类发酵产酸，以“＋”表示。若试管内倒置的小管内同时有气泡出现，则表示产酸和产气，以“茌”表示；若指示剂颜色未改变，则表示对糖类不发酵，以“－”表示。
半固体糖发酵培养基作穿刺接种，除观察产酸和产气外，尚可观察细菌的动力。
2.葡萄糖代谢型测定：又称葡萄糖氧化－发酵试验、O/F试验、H/L试验
（1）原理：氧化型的细菌是在有氧时分解葡萄糖，无氧时不能分解；发酵细菌是在有无氧时都能分解葡萄糖；产碱型细菌是在有无氧的情况下都不能分解葡萄糖，或产生碱者呈深紫色。
除指示剂外，溶解以上各成分，调整pH值为6.8～7.0，加入指示剂，分装试管，经115℃灭菌20min。
（3）试验方法：将试验菌穿刺接种，每株菌接4支，其中2支用无菌石蜡（0.5cm～1cm厚）封盖，以隔绝空气为闭管（厌氧）。另2支不加石蜡为开管（需氧）。同时设有不接种的闭管作对照。经37℃培养1、2、4、7d后观察，氧化型产酸者仅开管产酸；发酵型产酸者，则开管和闭管均产酸。如产气则在琼脂柱内产生气泡。开管闭管均不产酸者为产碱型。
3.葡萄糖酸盐的氧化试验
（1）原理：假单胞菌和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林试剂中蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu2O沉淀。
（2）试剂
pH7.2的磷酸缓冲液
使用时将甲液和乙液等量混合，当日使用。
（3）试验方法：用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含有1%的葡萄糖酸钠（或葡萄糖酸钙）溶液，分装于刻度试管，每管2ml。取18～24h的试验菌菌苔加入盛有2ml l%葡萄糖酸钠液试管至3ml，制成混悬液，置30℃过夜，每管加0.5ml斐林试剂。放入沸腾的水浴中加热10min，试管中液体由蓝色变为黄绿、绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，不变色者为阴性。
4.甲基红试验（M·R试验）
（1）原理：M·R试验是测定细菌分解葡萄糖产酸的程度。若所产生的酸足以降低pH值到4.2或更低，此时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红变色范围为pH4.4红色至pH6.0黄色。
各成分溶解后，调整pH值为7.2～7.4。分装试管。经115℃灭菌20min后备用。
先将甲基红研磨溶解于酒精中，再加蒸馏水即成。
（4）试验方法：将试验菌接种培养基中，37℃培养48h。取少量培养液于另一小试管中，并加几滴试剂，如培养液呈现红色，则甲基红试验为阳性；黄色者为阴性，仍继续培养4～5d再进行试验。
5.维培二氏试验（VP试验）
（1）原理：某些细菌能分解葡萄糖产酸，并将酸转化为乙酰甲基甲醇或2，3－丁二醇等中性物质。若在其中加碱并充分振荡，两种物质可被氧化为二乙酰，它再与培养液中的胍基结合生成红色化合物。
（2）培养基：同M·R培养基。
（3）试剂及方法
①Barritt’s试剂法：甲液：6％a－萘酚酒精溶液。
乙液：40％氢氧化钾溶液。
取M·R试验的同一培养物约2ml，加入甲液1ml，乙液0.4ml，充分混合，观察结果。
②O’Meara’s试剂法
取上述同一培养物约2ml，加等量试剂充分振荡试管混匀。
③硫酸铜试剂法
硫酸铜溶于40ml浓氨水中，加10%氢氧化钾即成。试验时加等量的试剂于培养物中混合。
上述几种方法，在5min内呈粉红色反应为阳性；如为阴性反应，置37℃4h后，再行观察。
6.淀粉水解试验
（1）原理：许多细菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不呈现蓝色。
装入三角烧瓶，经121℃灭菌20min。
（3）试剂：鲁格（LugoI）氏碘液（见革兰氏染色法）。
（4）试验方法：将培养基熔化后，冷至50℃左右，倒成平板，凝固后，取试验菌点种于平板上，每皿可点种3～5个菌株，37℃培养48～72h。形成菌落后，在平板上滴加鲁格氏碘液，必须以铺满菌落周围为宜。菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，平板仍呈蓝色。
7.β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
（1）原理：具有半乳糖苷酶的细菌，能水解ONPG而释放出黄色的邻硝基酚。
（2）试剂
①缓冲液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）6.9g，溶解于45ml蒸馏水中，加约3ml30%氢氧化钠，调pH7.0，并补足水至50ml，放4℃冰箱中备用。若析出结晶，用前稍加温使其溶解。
②ONPG液：称取80mg ONPG（邻硝基酚β－半乳糖苷），溶于15ml蒸馏水中，置37℃中，加入5ml缓冲液。溶液应是无色，置4℃冰箱保存，若出现黄色，则不能应用。使用前，先将ONPG液加温至37℃。
（3）试验方法：将试验菌接种到三糖铁或1%乳糖肉汤琼脂上，经37℃培养过夜。挑取1满环试验菌置于0.25ml生理盐水中，制成悬液，置37℃5min，加1滴甲苯，摇匀，以利于半乳糖苷酶的释放。取0.25ml ONPG液加入悬液中，置于37℃水浴中，分别在30min和3h后观察，若呈现黄色者为阳性。
8.七叶苷水解试验
（1）原理：有些细菌能分解七叶苷，其代谢产物与铁离子结合，产生黑色沉淀。
除指示剂及琼脂外，各成分溶解后，调整pH值为7.0，加入琼脂煮沸溶解后，再加入指示剂，混匀后，分装试管。经115℃灭菌20min，摆成斜面。省去琼脂，液体培养基同样可用。
（3）试验方法：将培养18～24h的试验菌接种于上述培养基上，37℃培养24h观察，若培养基变黑色则为阳性。
9.石蕊牛乳试验
（1）原理：在牛乳中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊在中性时呈淡紫色；酸性时呈粉红色；碱性时呈蓝色；还原时则自下而上褪色。
（2）培养基
①脱脂乳的制备：取新鲜牛奶，煮沸后冷却，经两次离心（3000r/min，10min），除去上层脂肪，即得脱脂乳。
将石蕊浸泡在蒸馏水中过夜，使石蕊变软易溶解，必要时再用乳钵研磨，过滤即得石蕊液。
混匀后，分装试管，间歇灭菌3次。如培养厌氧菌，则在乳上面加盖一层灭菌石蜡。
（3）试验方法：试验菌接种培养基中，37℃培养1～7d，观察产酸、产碱、胨化等反应。
①产酸：细菌发酵乳糖产酸，使石蕊变红。
②胨化：细菌产生蛋白酶，分解酪蛋白，故牛乳变得澄清。
③产碱：细菌分解酪蛋白产生碱性物质，使石蕊变蓝。
④酸凝固：细菌发酵乳糖，使石蕊变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固。
⑤凝乳酶凝固：某些细菌能产生凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，此时石蕊呈蓝色或不变色。
⑥还原：细菌生长旺盛，使培养基氧化还原电势降低，因而石蕊褪色。
10.甘油品红试验
（1）原理：甘油经酵解作用生成丙酮酸并脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物呈紫色。
（2）培养基
溶解以上各成分，pH值为8.0。
取A加D后，121℃灭菌15min备用。临用时加入B和C，分装无菌试管。
（3）试验方法：试验菌接种于上述培养基中，37℃培养，观察8d，并设同样培养基作空白对照。阳性呈紫色，弱阳性呈紫红色，阴性与对照管颜色一样。
（二）蛋白质及氨基酸代谢试验
1.靛基质试验（吲哚试验）
（1）原理：有些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而产生吲哚，吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛作用，可形成玫瑰吲哚而呈红色。
（2）培养基
溶解各成分，调整pH值为7.4～7.6，分装试管，经115℃灭菌20min。
溶解各成分，调整pH值为7.4～7.6，分装试管，经115℃灭菌20min。
（3）试剂：（此配方为Koracs试剂）
对二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中，再缓缓加入浓盐酸即成。
（4）试验方法。试验菌接种于培养基中，37℃培养24h～48h后，滴加试剂数滴于培养物液面，轻轻摇动，红色为阳性反应，黄色为阴性反应。
2.硫化氢试验
（1）原理：某些细菌能分解培养基中含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢与铁盐（或铅盐）相遇形成黑色硫化铁（或硫化铅）。
（2）培养基
营养琼脂融化后，加入硫代硫酸钠混匀，115℃灭菌20min后备用。临用前加热熔化，加入灭菌的醋酸铅溶液，混匀后，分装于无菌试管，直立凝固。
除醋酸铅溶液外，各成分加热熔解，pH值为7.6，经115℃灭菌20min，取出冷却至55℃左右，加入灭菌的醋酸铅溶液，混匀，分装试管，直立凝固。
注：穿刺接种后，应放在厌氧环境中培养；如用蛋白胨，用量改为20g。
③三糖铁琼脂或硫酸亚铁琼脂，用于肠杆菌科细菌测定产生硫化氢能力。
（3）试验方法
①试验菌穿刺接种于培养基中，置37℃培养2～4d，如穿刺线上或试管底部变黑，则为阳性反应。
②醋酸铅纸条法：首先将灭菌、烘干的滤纸条（6.5cm×0.6cm），浸泡在灭菌的饱和醋酸铅溶液（10g醋酸铅溶于50ml沸蒸馏水中，即为饱和醋酸铅溶液），浸透后取出，置无菌平皿内，37℃，烘干，保存于灭菌试管中。试验方法是将试验菌接种于营养肉汤或肝浸汤琼脂斜面，取一片醋酸铅滤纸条，夹在试管的棉塞下悬挂，置37℃培养1～2d，滤纸条变黑或棕褐色者为阳性反应。
3.尿素酶试验
（1）原理：某些细菌含有尿素酶，能分解培养基中的尿素，产生大量的氨，使培养基变碱而呈粉红色。
除尿素液、指示剂及琼脂外，各成分加热熔解，pH6.8～6.9，加入琼脂熔化后，再加指示剂混匀，115℃灭菌20min。取出培养基冷却至55℃，以无菌操作加入20%尿素液20ml，混匀后，分装无菌试管，摆成高层斜面。亦可制成液体培养基。
（3）试验方法：将试验菌浓密地接种在培养基中，置37℃培养3～12h，如接种于液体培养基并在37℃水浴中孵育，则得出结果更快。若培养基变粉红色者为尿素酶试验阳性。
4.明胶液化试验
（1）原理：明胶是一种动物性蛋白，某些细菌产生的蛋白酶可使明胶蛋白分解。明胶培养基本身低于20℃凝固，高于24℃自行液化。明胶分解后其分子变小，虽在低于20℃的温度下亦不再凝固。
（2）肉汤培养基
明胶加入煮沸的肉汤中，在水浴中加热熔化，分装试管，经113℃灭菌20min。保存于4℃冰箱备用。
（3）试验方法：用穿刺法接种在试管中央，在20℃温箱中培养，一般细菌培养7d，缓慢液化的细菌应培养1个月。如明胶液化，则记录液化明显的时间。如夏天没有20℃的培养条件或在20℃温度下不能生长的细菌，则需培养在所需温度下。观察时，将试管取出放入4℃冰箱内30min，若仍不凝固者为阳性。
5.酪蛋白分解试验
（1）原理：有些细菌能产生酪蛋白酶，分解酪蛋白，使菌落周围和下面酪蛋白被分解而产生透明轮廓。
（2）培养基：脱脂奶粉5g加蒸馏水至50ml（或用50ml脱脂牛奶），流通蒸气灭菌。琼脂1.5g加蒸馏水50ml，121℃灭菌20min。待冷却至45℃～50℃时，混合均匀，倾注平板。
（3）试验方法：平板倒置过夜，使表面水分干燥。将试验菌点种在平板上，每皿可点种3～5株。室温培养1、3、5d，记录菌落周围和下面酪蛋白是否已被分解而呈透明。
6.酪氨酸水解试验
（1）原理：酪氨酸为针状结晶，25℃时每1000ml水能溶解0.453g。具有酪氨酸酶的细菌能分解酪氨酸为更易溶于水的物质（如酚及丙氨酸），故菌落附近的结晶酪氨酸消失。
营养琼脂熔化后，加入酪氨酸，完全混匀后，分装试管，经121℃灭菌30min，倾注平板或摆成斜面。
（3）试验方法：将试验菌接种后，置37℃培养3～7d，观察细菌生长附近的结晶酪氨酸（其溶解度低，故现结晶），若有消失为阳性反应。
7.氨基酸脱羧酶试验
（1）原理：有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基脱出，生成胺类和二氧化碳，培养基中含胺类时呈碱性反应。
（2）培养基（此配方为Moeller氏法）
除指示剂外，将以上各成分溶解，调整pH值为6.0，加入指示剂。将基础培养液分成4等份，其中3份分别加入L－精氨酸、L－赖氨酸、L－鸟氨酸，使其浓度达1%。再调pH值为6.0。未加氨基酸的1份作为空白对照。分装小试管，每管3～4ml，上面加一层液体约0.5cm厚石蜡，115℃灭菌20min。
（3）试验方法：将试验菌接种上述培养基中，37℃培养18～24h观察结果。如指示剂呈紫色者为阳性反应；呈黄色者为阴性反应；对照管应为黄色。
8.精氨酸双水解酶试验
（1）原理：精氨酸经精氨酸脱酰酶的作用，降解为胍氨酸和氨，胍氨酸再经胍氨酸酰脲酶的作用，降解为鸟氨酸、二氧化碳和氨；培养基变碱。
（2）培养基：
除酚红外，将以上成分加热熔解，调整pH值为7.0～7.2。加入指示剂，分装试管，并设有不含氨基酸的对照管，121℃灭菌20min。
（3）试验方法：取幼龄菌穿刺接种，同时接种不含氨基酸对照管，并用灭菌石蜡封管。适温培养3、4、7d。若培养基转为红色者为阳性（精氨酸脱梭酶阳性者，亦可引起培养基变红，精确方法是用液相色谱鉴定）；呈黄色者为阴性；对照管应是黄色。
9.苯丙氨酸脱氨酶试验
（1）原理：某些细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨生成苯丙酮酸，苯丙酮酸与三氯化铁作用形成绿色化合物。
（2）培养基：
除琼脂外，以上各成分溶解后，调整pH值为7.4，加入琼脂熔化，分装试管，每管3～4ml，经115℃灭菌15min，制成斜面备用。
（3）试剂：10%三氯化铁水溶液。
（4）试验方法：将试验菌接种于上述培养基，37℃培养18～24h（以细菌生长旺盛为佳）后，取出加10%三氯化铁4～5滴，斜面呈现绿色者为阳性反应。
（三）碳源与氮源利用试验
1.枸橼酸盐利用试验
（1）原理：某些细菌能利用枸橼酸盐作为唯一碳源，利用磷酸二氢铵作为氮源，能在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐产生碳酸盐，使培养基变碱。
（2）西蒙氏（Simmons）枸橼酸盐培养基
除指示剂和琼脂外，加热熔解各成分，调整pH值为6.8～7.0，加入琼脂熔化后，再加入指示剂，分装试管，121℃灭菌20min，摆成斜面，亦可制成液体培养基。
（3）试验方法：将试验菌先划线后穿刺，37℃培养1～2d，阳性者斜面上有细菌生长，培养基由草绿色转为蓝色。阴性者不见有细菌生长，培养基仍为绿色。
2.丙二酸钠利用试验
（1）原理：当细菌利用丙二酸钠作为惟一的碳酸钠，使培养基变碱，呈蓝色。
（2）培养基：
除指示剂外，各成分混合溶解，调整pH值为6.8，加入指示剂，分装试管，115℃灭菌30min。同时设一份不加丙二酸钠的作空白对照。
（3）试验方法：将试验菌分别接种丙二酸钠培养基和空白对照培养基，37℃培养1～2d。如测定培养基有细菌生长并变蓝色，表示试验菌可利用丙二酸盐，为阳性反应。如测定培养基未变色，空白对照培养基也不生长，表示此培养基成分不适于试验菌生长，应另选择合适的培养基进行测定。如测定培养基未变色，而空白对照培养基上能生长，则为阴性结果，表示试验菌不利用丙二酸盐。
3.醋酸钠利用试验
（1）原理：某些细菌可以利用铵盐作为唯一的氮源，同时利用醋酸盐作为唯一的碳源时，可在醋酸盐培养基上生长，并分解醋酸盐生成碳酸盐，使培养基变碱。
（2）培养基：
除指示剂和琼脂外，溶解各成分，调整pH值为6.8～7.0，加入琼脂熔化后，再加指示剂，培养基呈草绿色，分装试管，121℃灭菌20min后摆成斜面。亦可制成液体培养基。
（3）试验方法：将试验菌接种于斜面培养基或液体培养基中，37℃培养1～2d，若培养基由草绿色转为蓝色者为阳性反应。
4.马尿酸钠水解试验
（1）原理：B群溶血性链球菌有马尿酸钠水解酶，可使马尿酸钠水解为苯甲酸和乙氨酸，而苯甲酸与三氯化铁相结合，形成稳定的有色的苯甲酸铁沉淀。
（2）培养基：
将马尿酸钠溶解于牛肉汤培养基中，分装于小试管内，加塞包好，置121℃蒸气灭菌20min。
混合溶解。
（4）试验方法：将试验菌接种于马尿酸钠培养基上，置37℃培养2～4d。取培养物0.8ml，加试剂0.2ml，立刻混合均匀，经10～15min，观察结果，如管内出现经久不消失的褐色沉淀，则表示马尿酸钠已水解为苯甲酸，是阳性反应。
5.葡萄糖铵利用试验
（1）原理：某些细菌可利用铵盐作为唯一的氮源，且不需要尼克酸和某些氨基酸作为生长因子时，可以在此培养基上生长，分解葡萄糖，使培养基变酸，呈黄绿或黄色。
（2）培养基：
除琼脂和指示剂外，各成分溶解后，调整pH值为6.8，加入琼脂熔化后，再加入指示剂，分装试管，115℃灭菌20min，放置斜面。
注：容器使用前用清洁液浸泡过，再用清水、蒸馏水冲洗干净，并用新棉花做棉塞，干热灭菌后使用。如果操作时不注意，有杂质污染时，易造成假阳性。
（3）试验方法：用接种环蘸取少量试验菌，在生理盐水管做极稀的菌悬液。将接种环灭菌，再挑取菌悬液少许接种，同时再以同法接种普通琼脂斜面一支作为对照。37℃培养24h。若试验管斜面上有正常大小菌落生长，培养基变黄者为阳性反应；阴性者无菌生长；对照培养基上生长良好。
6.有机酸盐利用试验
（1）原理：酒石酸受细菌酶的作用，分解为乙酸、草酸等比较简单的有机酸。枸橼酸通过三羧酸循环，可被分解为各种比较简单的有机酸，如琥珀酸、乳酸、乙酸等。这些有机酸的生成，可使pH值下降，指示剂颜色由蓝变黄，甚至变白。同时未被分解的酒石酸和枸橼酸与铅离子形成铅盐沉淀，若与阴性对照相比，可以判定反应的程度。细菌对酒石酸异构体的分解具有特异性。黏液酸分解后，可以生成简单的有机酸，用指示剂指示出酸性反应。
（2）培养基：
另备5mol的NaOH若干毫升。
取前3种成分混合，加热熔解，分成5份，每份200ml，分别加入以下各试剂1种，待熔解后，分别以5mol/L的NaOH调整到pH7.4。按规定量加指示剂，分装，每管3～4ml，在121℃灭菌20min，置冰箱内备用。
（3）试验方法：用接种环将20h的肉汤培养物接种到有机酸培养基上，置37℃培养14d，每天观察，记录颜色变化。能分解酒石酸、枸橼酸、黏液酸者，指示剂由蓝变黄绿，直至白色，阴性者仍为蓝色。
在试验结束时，向酒石酸盐、枸橼酸盐管内加0.5ml的醋酸铅饱和水溶液，阳性管只有少量沉淀，阴性管有大量铅盐沉淀，24h后约占2/3液柱高度，与对照管相同。
4.酶类试验及其他试验
1.氧化酶试验
（1）原理：氧化酶（即细胞色素氧化酶），在有分子氧和细胞色素C存在时，可氧化盐酸二甲基对苯二胺产生红色反应。若加等量α－萘酚酒精溶液，则形成吲哚酚蓝，出现蓝色反应。
（2）试剂：l%盐酸二甲基对苯二胺（或盐酸四甲基对苯二胺）水溶液（装于棕色瓶中在冰箱中贮存）。1%α－萘酚酒精（95%）溶液。
（3）试验方法：取一张白色滤纸条，滴上1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，以湿润为宜。用细玻棒（或牙签）蘸取幼龄试验菌，涂抹在滤纸条上，10s内出现红色者为氧化酶试验阳性。用1%盐酸二甲基对苯二胺液湿润滤纸条后，再加等量的1%α－萘酚酒精溶液，然后再涂抹试验菌，10s内出现蓝色者为阳性。取质量较好的滤纸，先剪成约lcm宽的滤纸条，浸泡在1%盐酸二甲基对苯二胺试剂中（或加等量的1% x－萘酚酒精溶液），在室温下风干，放在带橡皮塞的大试管中，置冰箱中保存数月。使用方法同上。
（4）注意事项：1%盐酸二甲基对苯二胺溶液易氧化，应保存在棕色瓶中，贮存于4℃冰箱中，若溶液变红褐色，不宜使用。本试验避免含铁物质。遇铁物质催化盐酸二甲基对苯二胺呈红色反应，造成假阳性，故用细玻棒（或牙签）挑取试验菌。在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸条为宜，如滤纸过湿，会纺碍空气与试验菌接触，而延长了反应时间，造成假阴性。
2.过氧化氢（触酶）试验
（1）原理：有些细菌具有触酶，能催化过氧化氢分解成水和氧。
（2）试剂：3%过氧化氢（H2O2）溶液，临用时配制。
（3）试验方法：取干净的载玻片，在上面滴l滴3%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，在过氧化氢溶液中混匀，若有气泡出现则为阳性，无气泡产生者为阴性。取3%过氧化氢溶液2ml加入干净的小试管中，用细玻棒蘸取试验菌，插入过氧化氢液面下，若有气泡产生者为阳性。
（4）注意事项：因为过氧化氢酶是以正铁血红素作为辅基的酶，所以试验菌不应培养在含有血液的培养基上生长，因为这种培养基上生长的细菌易产生假阳性反应。
3.硝酸盐还原试验
（1）原理：某些细菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成对重氮苯磺酸，再与α－萘胺结合，生成N-x-萘胺偶氮苯磺酸，呈红色反应。
（2）硝酸盐培养基：
混合上述成分，加热熔解，调整pH值至7.4，分装试管，121℃蒸气灭菌20min备用。
（3）厌氧菌硝酸盐培养基：
取上述成分混合，加热熔解，调整pH值为7.2，过滤、分装，121℃蒸气灭菌20min备用。
（4）试剂
先将二苯胺溶于浓硫酸中，再用蒸馏水稀释。
（5）试验方法：将试验菌接种于硝酸盐培养基中，同时设不接种的对照管，于37℃培养3～4d。用两支干净小试管，每天取培养液少许放入试管中，再各滴1滴甲液和乙液，对照管同样加试剂。若试验管菌液呈现红色、橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加1、2滴二苯胺试剂。若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝盐已被还原成其他物质，仍应按硝酸盐还原试验阳性反应（还原能力强的细菌，可把硝酸盐全部还原成氮）。
4.卵磷脂酶试验
（1）原理：某些细菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂生成脂肪和水溶性的磷脂胆碱，使卵黄发生浑浊现象。
（2）培养基：取新鲜鸡蛋，冲洗干净，浸泡在75%酒精中15～20min，用无菌纱布擦干。无菌操作打开蛋壳，将蛋黄和蛋白分开，蛋黄盛于含有无菌玻璃珠的三角烧瓶中，加入等量的灭菌生理盐水，用力振摇，制成卵黄悬液。取10ml卵黄液加到已熔化、冷却到50%的200ml营养琼脂中，倾注平板，过夜后使用。或取5ml卵黄液加入灭菌的100ml营养肉汤中，混匀分装无菌试管，制卵黄液肉汤管。
（3）试验方法：试验菌点种在卵黄琼脂平板上，每皿可点种3～4株。37～C培养24～48h观察，如在菌落周围形成乳白色混浊环者为阳性反应。若试验菌为厌氧菌，则需要在点种皿上面加盖无菌玻片或进行厌氧培养。
5.磷酸酶试验
（1）原理：许多细菌有磷酸酶。它可以使磷酸酯水解。本试验主要用于致病性葡萄球菌与其他葡萄球菌的鉴别，以及沙雷氏菌属与肠杆菌的鉴别。
（2）培养基：
取营养琼脂熔化并冷却至50%时，再加入过滤除菌的1%磷酸酚酞溶液，摇匀制成平板。
（3）试验方法：将试验菌接种在上述培养基上，37℃培养24h后，打开平板，使培养基表面向下，用浓氨水熏片刻，如有酚酞释出，则菌落变为粉红色，即为阳性反应，否则为阴性。
6.血浆凝固酶试验
（1）原理：病原性葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变成不溶解性的纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而有对抗吞噬的作用。凝固酶试验对于判断菌株是否具有致病力很有帮助。葡萄球菌所产生的凝固酶有两种，一种是与细胞壁结合的结合凝固酶，它直接作用于血浆中的纤维蛋白原，使其发生沉淀，包围于细胞外面凝聚成块，玻片试验的阳性结果就是由此酶引起的。另一种由菌体生成后释放于培养基中，叫做游离凝固酶，它能使凝血酶原变成凝血酶，试管法阳性和其有关系。
（2）试验方法
A.载玻片法 载玻片一端用蜡笔划直径约1.5cm的圆圈，加生理盐水1滴，挑取菌落浮悬于盐水中，混合均匀，使浑浊似乳后滴加兔（或人）血浆1滴，充分混匀近1min；玻片另一端以血浆和盐水作对照。有细菌的血浆出现凝块而对照无，为凝固酶阳性；二者均无凝块者为阴性。
血浆制备 取无菌兔血（或人血）立即与1/5的抗凝剂（0.1%肝素或5%柠檬酸钠）混匀，以1500～3000r/min离心15min，取上清液（下为红细胞等）即为血浆，以新鲜制备为宜。保存于冰箱中的，要经过试验有效才用。
B.试管法 将新鲜的兔或人血浆用生理盐水作1∶4稀释，取0.5ml置于小试管中，挑取几个培养24h的菌落混悬于内成浓厚的悬液，并用已知阳性菌作对照，共置于37℃水浴中4～6h，每半小时观察1次，全部或部分凝固者为阳性。
7.DNA分解试验
（1）原理：有些革兰氏阳性细菌，产生DNA酶，分解培养基中的DNA，形成由几个单核苷酸组成的寡核苷酸，而长链DNA可被酸沉淀，寡核苷酸链可溶于酸，在菌落周围形成透明环。
（2）培养基：
各成分混合后，经121℃20min灭菌，取出冷却至50℃左右，加入DNA（1.0g溶于无菌蒸馏水l00m1）l0m1倾注平板。
（3）试验方法：将试验菌点接到平板培养基上，37℃培养过夜。在菌落周围绿色质地上产生一个无色透明环者为阳性。
8.凝固血清液化试验
（1）原理：某些细菌能产生蛋白酶，可使凝固血清液化。
（2）吕氏血清培养基：
将肉汤与血清按比例混合，分装于无菌试管内，每管5ml，在血清凝固器上，使成一定角度，制成斜面，间歇灭菌3次，第一次80℃1h，第二次85℃1h，于37℃温箱过夜，第三次90℃1h；于37℃过夜，污染的斜面废弃。
（3）试验方法：取细菌纯培养物接种在吕氏血清培养基表面，于37℃培养2～7d，可见到菌落下陷，菌落周围液化，即为液化阳性。
9.氰化钾抑菌试验
（1）原理：氰化钾可以和铁卟啉结合，因此，有铁卟啉的酶，如细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶，与氰化钾结合后，使酶失去活性，而细菌的生长受到抑制。在肠杆菌科中沙门氏菌、志贺氏菌和埃希氏菌等3个属的细菌，氰化钾有抑制生长的作用。
（2）培养基：
取上述成分加热熔解，调整pH值为7.6，121℃灭菌20min，置冰箱内充分冷却后，以无菌操作法加入氰化钾（每1000ml培养基加0.5%氰化钾液20ml，使氰化钾最终浓度为1∶1000）分装于无菌试管内，每管1ml，用蘸有热石蜡的软木塞塞紧，在4℃下可保存28d，同时要以不加氰化钾的肉汤作对照。
0.5%氰化钾液：取0.5g氰化钾加入无菌的蒸馏水100ml中混匀即可。
（3）试验方法：取幼龄试验菌接种于氰化钾培养基和空白对照培养基，置37℃培养24～48h，观察生长情况。试验菌能在氰化钾培养基上生长，表示氰化钾对试验菌无毒性作用，为阳性。试验菌在氰化钾培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养不适于试验菌的生长，必须选用合适的培养基。若试验菌在空白培养基上生长，在氰化钾培养基上不生长，为阴性。
（4）注意事项：氰化钾是剧毒药品，操作时必须非常小心，培养基用完后，每管加几粒硫酸亚铁和0.5ml 20%氢氧化钾溶液去毒，然后才可清洗。
三、细菌运动性检查
有些细菌具有运动能力，可以独立运动；另一些细菌则没有运动能力。在显微镜下观察，细菌的真正运动（自由运动）表现为能离开原来的位置，不断改变方向的自由地游动。水的分子运动（布朗氏运动）也能见于细菌个体，使其在原地摆动，但不能远离原来位置移动；或者由于细菌所在的液体放置不平，发生液体流动，细菌亦随水流方向漂流移动。这两种情况，都是外力作用的结果，不是细菌本身的真正运动。检查细菌运动力，应使用细菌幼龄培养物，最好刚从温箱中取出，并在温暖的环境下尽快进行。
（一）直接镜检法
1.悬滴检查法
（1）制片：取洁净凹玻片一块，于其凹窝的四周均匀地涂以适量的凡士林。另取洁净盖玻片一块，如待检细菌为固体培养物，用接种环取1滴生理盐水或透明肉汤滴于盖玻片的中央，再用接种环挑取少量固体培养物，混匀于液滴内；如待检细菌为液体培养物，则可直接用接种环取1滴于盖玻片上；然后翻转盖玻片，使液滴朝下，轻轻盖在凹玻片的凹窝上，略加轻压，使盖玻片四周与凡士林紧密接触，将凹窝封闭并粘牢盖玻片，悬滴样本片即制成。如只作短时间的观察，也可不用凡士林，而是用水将凹玻片的凹窝四周湿润，或甚至水也不用，只盖上盖玻片即可。
（2）镜检：将显微镜置于平坦、稳固的显微镜台上，装上悬滴标本片后，先用低倍镜观察，找到液滴后将其移至视野的中央，调整光线后换用高倍镜，一般在高倍镜下即可观察到细菌运动情况。在观察时，必须缩小光圈，适当降低聚光器，以造成一个光线较弱的视野，便于观察。必须使用油镜观察时，应防止压碎盖玻片。
2.压滴检查法 本法主要用于检查浑浊或浓稠的液体病理材料（如血液、脓汁、稀粪、渗出液等）以及固体病理材料中的细菌的运动性。
（1）制片：取洁净载玻片一块，于其中央滴1滴生理盐水，再用接种环取少量固体病理材料于液滴中，混合均匀；取盖玻片一块，先将其一边与液滴边缘接触，液滴浸满整个边后将盖玻片徐徐放倒压盖在液滴上，注意避免产生气泡。
（2）镜检：同悬滴检查法。
3.暗视野显微镜检查法亦称为暗视野检查法。
（1）制片：方法同压滴检查法，但要选用厚度不超过1.5mm的薄载玻片，否则暗视野聚光器的斜射光交点将落在玻片内，而不能调整于液滴中，这样将看不到标本的影像。
（2）镜检：方法基本上同光学显微镜，但应注意以下特点。
①宜采用强光源，一般采用强光灯作光源，否则物像不清晰。
②调节光源，使光线集中在暗视野聚光器上。先用低倍镜观察，移动暗视野聚光器，使其中央的一个圆圈恰好处在视野的中央；如聚光器已调整固定好，可省略此步骤。
③先在聚光器上加1滴香柏油，然后将样本片放在载物台上，上移聚光器，使其上的香柏油与样本片的底面接触，注意中间不能形成气泡。
④在样本片的盖玻片上加1滴香柏油，旋转粗调节螺旋，使镜头浸在香柏油内，边观察边用粗、细调节螺旋调焦，必要时需稍微升降聚光器以调节斜射光交点，使其正好落在样本上，并可调节油镜头的光圈，三者相互配合，直至出现清晰的物像为止。
⑤当被检样本中有细菌存在时，则反射的光线通过镜筒达到目镜，在暗视野中可见到闪亮的小玻璃珠样的菌体。
⑥镜检完毕，关灯，将集光器放下，镜头提高，擦镜纸拭去物镜与集光器上的香柏油，其样本片放于消毒液中。
（二）培养检查法
1.半固体培养基穿刺培养法 用灭菌接种针蘸取纯培养物垂直穿刺接种于半固体培养基的琼脂柱内，置37℃恒温培养箱内培养18～24h后取出观察。有运动性的细菌可沿穿刺线向四周扩散生长，使培养基变浑浊；无运动性的细菌只能沿穿刺线生长，周围的培养基仍保持澄清。
2.平板挖沟培养法 预先制备好鲜血琼脂平板，以无菌手术在平板中心横过挖去一条1cm宽的琼脂条，使平板中间形成一条小沟，放置一条4cm×0.5cm的无菌滤纸横跨于两边培养基上，使与小沟相垂直。在滤纸条的一顶端接种待检细菌的纯培养物，置37℃温箱中培养，每天观察生长情况，直至7d，如接种端的隔沟对边亦生长出同样细菌，表示该菌有运动力。
四、细菌血清型鉴定
细菌抗原结构比较复杂，有存在于细胞壁的菌体抗原（O抗原），运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原（H抗原），它具有不同的种、型特异性。包围于细胞壁外面的抗原称表面抗原，包括种、型特异性很强的荚膜抗原（如炭疽杆菌）以及Vi抗原（沙门氏菌）和K抗原（大肠杆菌）。此外还有存在于某些革兰氏阴性杆菌表面的菌毛抗原。从抗原的特异性程度可区分为共同抗原和特异性抗原。存在于属间细菌所共有的共同抗原的存在，只能表明其属性、特异性抗原，只存在于特定的种、型，是最后确定细菌种、型的重要依据。血清型鉴定是微生物鉴定的特异方法。首先要求鉴定的细菌必须纯净，不能混有其他种细菌，而且要新鲜，细菌要在适宜的条件下培养，尽量减少传代，以防发生变异，其次是要有特异性强和效价高的已知标准免疫血清（包括单克隆抗体）和标准菌株。有些种类细菌，如大肠杆菌和沙门氏菌不仅种、型繁多，而且抗原构造复杂，应购置专门的分型血清以备应用。最后是根据其菌体构造和抗原成分以及实验室的设备技术条件，选择相应的一种或几种血清学试验方法进行鉴定。
五、细菌毒力测定
病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力。通常毒力越大，致病性就越强。同一种病原菌，因菌株不同，致病力大小也不相同，有强毒、弱毒和无毒株之分。细菌的毒力测定，在微生物实验研究中特别重要，尤其在疫苗效价、血清效价、细菌毒素的测定、食品毒理研究等，都必须预先将实验用的细菌（或毒素）的毒力加以测定。测定微生物毒力大小系用递减剂量的材料（活的微生物或毒素）进行毒力测定。测定方法系用递减剂量的材料（活的微生物或毒素）感染易感动物来进行。每次试验时，均须注意实验动物的种别、年龄与体重、试验材料和剂量、感染途径以及其他因素。因为这些因素都会直接影响毒力测定结果。其中感染途径与动物体重尤为重要。用来表示微生物毒力大小的单位有最小致死量（M.L.D）或最小感染量（M.I.D）和半数致死量（LD50）或半数感染量（ID50）两种。
最小致死（感染）量：能使特定的动物感染后，在一定时限内发生死亡（感染）的最小的微生物量或毒素量。这一测定毒力的方法比较简便，不过有时可能由于实验动物个体差异而结果有误差。
半数致死（感染）量：在一定的时限内能使半数实验动物发生死亡（感染）所需的微生物量或毒素量。试验时要选择年龄、大小、体重一致的动物，将动物分为若干个组，每组动物数量相等。然后用等量的试验材料感染同一组动物。各组动物所用的试验材料量均有一定差数。对每组动物加以记录，然后用数学方法计算半数致死量。
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