细菌活菌数的测定

一、细菌活菌数的测定

1．平板菌落计数法

平板菌落计数法是根据在固体培养基上生长的菌落计数，每一个菌落由一个单细胞繁殖而成，为肉眼可见的细胞群体。根据菌落数可以计算出待测菌液中的活菌数量。

（1）取水样1ml利用无菌水按10倍数作一系列稀释，水样稀释浓度以在平板上长出的菌落数在30～300个之间为宜。稀释时应尽量使微生物细胞分散开，否则易生长出片状菌苔。稀释过程参考实验五。

（2）以无菌操作用无菌移液管吸取1ml充分混匀的水样，注入无菌平皿中，再倾入约15ml已融化并冷却到45℃的营养琼脂培养基，迅速转动，使水样与培养基充分混匀。

（3）置水平位置静止凝固后，倒置于37℃下培养24小时。每个水样取3个连续适宜稀释菌液倒平板，各倾注3个平皿，同时做不加水样空白对照。

（4）待菌落生长好取出平皿计数，统计出同一稀释度一个平皿上菌落的平均数。根据以下公式计算：每毫升菌液中活菌总数＝同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数。

（5）菌落计数原则：先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平皿有较大片状的菌苔生长时，则不宜采用，而应以无片菌苔的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，可将此一半平皿计数后乘2以代表全皿菌落数。

首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则以该平均菌落数乘以其稀释倍数报告之（表10－1中例1）。

若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若其比例小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中稀释度较小的菌落总数（表10－1中例2、例3）。

若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（表10－1中例4）。

若所有稀释度的平均数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（表10－1中例5）。

若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（表10－1中例6）。

菌落计数报告，菌落数在100以内按实有数报告，大于100时采用两位有效数字，在两位有效数字后面的值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（表10－1中“报告方式”栏）。在报告“菌落无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。

表10-1　计算细菌菌落总数方法的示例

（6）细菌总数测定方法的改进。依上述方法观察计数，但深层较小菌落容易遗漏，造成计数上误差较大。由于多数细菌具有脱氢酶，在培养皿中产生脱氢作用，遇到氯化三苯基四氮唑（TTC）在平板上显现深浅不同红色小点或红色片状物均为细菌。TTC的投加量以0．01%及0．04%为宜，切忌TTC浓度过高，否则对细菌具有抑制作用。

使用该改进方法时，要注意如下情况：①要注意选择好倒平板的稀释度，一般以3个稀释度中的第二稀释度倒平板所出现的平均菌落数在50个左右为最好；②由3个稀释度（10^－4、10^－5、10^－6）计算出的每毫升菌液中总活菌数应很接近，如相差较大，表示试验不准确，应重做。

2．液体稀释法（MPN法）

此法也可进行活菌数计算，由于某些微生物在琼脂平板上不易生长，故不适用平板菌落计数，但在液体培养基中生长易于检查。因此，根据某些稀释菌液接种培养后所生长微生物的试管数，用统计数学方法计算出原样品的含菌量，此法也称为最或然数技术或最大可能数量法，简称MPN法。反硝化细菌、氨化细菌、类大肠杆菌及紫色非硫光合细菌均可利用此法计数。

操作时先将样品作一系列的10倍稀释，至最后一级稀释液接种后，不出现菌的生长为临界级数。取后5种稀释液接种于无菌的液体培养基中，一般需做3～5管平行实验。适温培养，根据生长菌试管数，确定数据指标，查出菌的近似值，再行计算。

下面以5管平行实验为例来介绍检验方法。其他3管、4管平行实验同理依次查表计算，一般要根据实验精确度要求选择管数，一般用3管平行实验即可。

（1）取1ml样品，按10倍作一系列稀释至10－10。

（2）利用无菌移液管分别从不同浓度稀释液中各取1ml，分别接种到5支已灭菌液体培养基试管中。适温培养2～14天，记录每个稀释液出现细菌生长的试管数来确定数量指标。注意每种稀释度必须更换一支移液管。

（3）数量指标的确定，不论重复系数多少均取3位数字。

1）如果生长情况如下：

表10-2　生长情况表一

取各重复管数都有菌生长的最高稀释度的生长管数，为数量指标的第一个数字，其后两个稀释度的生长管数作为其他的个数。就上例4个重复生长的有10^－3及10^－4两个稀释度，取其中高稀释度10－4，其中生长管数“4”作为数量指标的第一位数字；10^－5为3及10－6为1，因此所得数量指标为4、3、1。

2）如果生长情况如下：

表10-3　生长情况表二

依原则1）数量指标第一数字应取10－4的4，其后两个数字是“2”和“1”，可是更高稀释度10^－7中还有1管生长，因而需将这个管加在第三个数上，所以数量指标数为4、2、2。

3）如果生长情况如下：

表10-4　生长情况表三

所取数量指标应使有生长菌的管数位于中间。

确定数量指标后查附表1得出菌近似值。

（4）计算方法。利用以下公式计算原菌液的最大可能数。

1ml（g）样品中的菌数＝菌近似值×数量指标第一位数的稀释倍数。

3．滤膜过滤计数法

当单位体积水样中所含微生物数量较少时，可通过超滤膜过滤浓集后，再进行培养计数。

（1）滤膜主要是由硝化纤维制成的白色薄膜，根据实验要求可选择不同大小的孔径及直径。使用前应先经灭菌处理，将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15分钟。前两次煮沸后需更换水洗涤3次，以除去残留溶剂。

（2）利用无菌镊子取滤膜，安装于过滤器上，将过滤器装于抽滤瓶上，并与真空泵相连接。

（3）取适量水样放入过滤器漏斗内过滤，若水样量少应加无菌水稀释、混匀过滤，过滤水样多少根据漏斗直径决定。开动真空泵抽滤，使水样中微生物被截留在滤膜上。待水样全部滤完，立即停止抽滤。

（4）打开滤器，利用无菌镊子取下滤膜，过滤面向上放于平板培养基上，使滤膜与培养基之间贴紧，不可留有气泡。盖好培养皿盖，倒置适温培养，若培养时间较长可将小培养皿放于铺有湿脱脂棉的大培养皿内，以保持皿内湿度。每个水样做3个平皿培养。计算膜上菌落数，取平均值，计算出每毫升水样的含菌数。