细菌的药物敏感性鉴定

第四节　细菌的药物敏感性鉴定

各种致病菌对不同的抗菌药物（包括抗生素、磺胺类药、呋喃类药、沙星类药和中草药等）的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对同一抗菌药物的敏感性也有差异；同时抗菌药物的使用又可导致抗药菌株的产生或干扰机体内的正常微生物的作用，反而给机体带来不良影响。因此，测定细菌对抗菌药物的敏感性，选用有效的抗菌药物，对养殖生产具有重要意义。

一、药敏测定原理

测定抗菌药物在体外对病原微生物的生长有无抑制作用的方法，称为药敏试验，有的以抑制细菌生长为评定结果的标准，有的则以杀灭细菌为标准。

1.稀释法　以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列的不同倍数稀释，经培养后观察最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration或MIC）。常用试管法。

2.扩散法　将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此，敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成一个抑菌圈。常用纸片法、挖洞法。

稀释法测MIC的对数与从扩散法测得抑菌圈直径之间成直线关系。通过这两种方法相对应地测试一定量的菌株，可以得到一条代表这种关系的回归线，从试验中所得抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度。

二、常用药敏测定方法

（一）纸片法

纸片法简单易行，出结果快，是生产中常用的药敏试验法。

1.药敏纸片　购买标准药敏纸片或自制药敏纸片：取直径6mm的无菌滤纸片，浸于一定浓度的抗菌药液（药液配制见表5－1，或根据需要稀释药液）中。一般每毫升药液中浸滤纸片100片，浸泡1～2h后干燥备用，药剂维持1～2个月有效。

表5－1　药敏试验药液的配制

续表

注：①pH3枸橼酸缓冲液：枸橼酸7g、磷酸二氢钠3g、蒸馏水1000ml。

　　②pH6磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾2g、磷酸二氢钠8g、蒸馏水1000ml。

　　③pH7.8磷酸缓冲液：磷酸氢二钾16.73g、磷酸二氢钠0.523g、蒸馏水1000ml。

以上3种缓冲液分别加热将药物溶解后，用pH试纸或pH计测定酸碱度，高压蒸气灭菌。

2.培养基　根据不同细菌选择相应培养基，一般常用肉汤、普通琼脂、血琼脂、无胨琼脂（用于磺胺类药物，其配制方法：牛肉膏或酵母浸膏5g，氯化钠5g，琼脂25g，水1000ml，将各成分加热熔解，调整pH值7.2～ 7.4，过滤后分装，灭菌。临用时，将此培养基融化，倒入平板，凝固后，即可使用）。

3.菌种　从病料中分离、培养、纯化的细菌或用标准菌株（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等，为冷冻干燥品，保存于5℃～8℃冰箱内，一般可保存1～3年。使用时，无菌启开干燥菌种，接种于液体或斜面的菌种培养基上，于37℃培养24h，可见典型菌落。取菌种涂片、镜检，证明无杂菌存在，方可使用或放入冰箱5℃～8℃。试验用菌种每月传代一次，每季度平板分离一次）。

4.试验方法

（1）化学消毒剂的杀菌作用：用经火焰灭菌的接种环，挑取细菌的纯培养物（量要适当多一点），以划线接种方式涂布到培养基表面。也可挑取待试验细菌在少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌的棉拭子蘸取菌液，或用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液，致密而均匀地涂布到培养基表面。以灭菌镊子夹取纸片（直径6mm）分别浸于消毒剂（如0.1%升汞、5%石炭酸、2%来苏儿、2%碘酊等）中，每种消毒剂浸2片。浸透后，再将纸片一一取出（使纸片与管壁接触，以除去多余的药液），分别放在已接种细菌的琼脂平板表面，各纸片间的距离要大致相等。置37℃培养24h，观察结果。测量各消毒剂纸片周围的抑菌圈，并记录、分析试验结果。

（2）细菌对抗生素等药物的敏感试验：测定细菌对抗生素等药物的敏感度，可供临诊上正确选用药物时参考。

用经火焰灭菌的接种环，挑取细菌的纯培养物（量要适当多一点），以划线接种方式涂布到培养基表面。也可挑取待试验细菌，在少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌的棉拭子蘸取菌液，或用灭菌的棉拭子蘸取细菌培养液，致密而均匀地涂布到培养基表面。用灭菌尖头镊子，镊取已制备好的各种干燥抗菌药纸片，分别贴到培养基表面（为了贴紧可用镊子按一下纸片）。纸片在培养基上，一般在中央贴一种纸片，这样一只平板（90mm²）可贴6～7个抗菌药纸片。如果药敏纸片没有标记，在每贴一种纸片后，应在平板底的对应部位上，用蜡笔写上药品名或贴上标签。将贴纸片的平板底部向上，置37℃温箱内培养24h，取出观察结果。

5.结果与判定标准　经培养后，有抑菌能力的抗菌药物，在纸片周围出现一个无菌生长的圆圈，称为抑菌圈。抑菌圈越大，说明该菌对药物的敏感性越大，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。

判定结果时，应按抑菌圈直径大小（mm）来判定敏感度高低的标准。一般抑菌圈直径20mm以上为极敏，15mm～20mm为高敏，10mm～15mm为中敏，10mm以下为低敏。

（二）试管法

试管法比纸片法复杂，但试验结果准确可靠。因此，不仅能用于各种抗菌药物对细菌的敏感性测定，也可用于定量检查。

1.试验方法　取试管10支排放在试管架上，于第一管中加上肉汤1.9ml，其余各管均各加1ml。吸取配好的抗生素、磺胺药或中草药原液0.1ml，加入第一管，混合后吸取lml放入第二管，混合后再由第二管移1ml到第三管，依此类推，直到第九管，吸取lml弃掉；第十管不加药液作对照。然后各管内加入幼龄试验菌0.05ml（培养18h的菌液，1∶1000稀释），于37℃温箱内培养18～24h，观察结果。

2.结果判定　培养18h后，凡无菌生长的药物的最高稀释管，即为该菌对药物的敏感度。若由于药物本身混浊，肉眼不易观察时，可将各稀释度的细菌再接种到新的培养基或涂片镜检，加以判定。其判定标准见表5-2。

表5-2　试管法药敏试验结果判定

3.挖洞法　挖洞法是在接种的平板上挖洞，然后把药放在洞内，又称琼脂孔法。适用于中草药煎剂、浸剂或不易溶解的药物。

（1）原液的配制：有水煎剂和粉剂两种。粉剂可直接将中草药压碎研磨成细粉。水煎剂多配成1g/ml的溶液（取一定量的中草药，磨粉，加5～10倍量的水，或以水量淹没药物为止，煮沸1h，过滤，滤渣再加同量水，再煮沸1h，滤过。然后将两次的滤液混合，加热浓缩至每毫升相当于1g生药的浓度，经8Ib灭菌15min）。

（2）培养基：一般用普通琼脂或血液琼脂平板。

（3）菌液：幼龄肉汤培养物（培养10～18h）。

（4）试验方法：用接种环取培养物少许或用灭菌棉棒蘸取培养物，均匀地涂布于琼脂平板上。以直径3mm的金属管在培养基上打孔，并于孔底加1滴熔化的灭菌琼脂，以密封孔底。然后加药于孔内，其剂量为0.025ml，粉剂则加满，于37℃温箱中培养24～48h。

（5）结果判定：可按纸片法测量抑菌圈的直径判定。

（三）根据药敏试验选药原则

完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则。

1.在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。

2.药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70%～ 80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。如发现疗效不显著应及时换药。

3.药敏试验确定的首选药物不是一成不变。随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。

4.窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。

5.避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

（四）影响药敏试验结果的因素

1.培养基　首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。培养基的成分不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。其次，倾注平板时，厚度应合适（5～6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，以倾注培养基18～20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

2.细菌接种量　细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3.药物浓度　药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4.培养时间　一般细菌培养温度和时间为37℃12～24h，有些抗菌药扩散慢，如多黏菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2～ 4h，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

（五）药敏试验存在的问题

1.方法学不统一，没有标准化。

2.市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。所以还是建议按要求自制药敏纸片。

3.因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1∶5加生理盐水研磨制成悬液，静置5min，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5min后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。

4.对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。

5.部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮番使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，延误治疗时机和浪费药品。一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。