化疗是目前治疗恶性肿瘤的重要手段之一,可根据药物敏感试验检测结果指导选药,有效的提高化疗效果。肿瘤细胞药物敏感实验检测法有染料排斥法、集落形成法、放射性核素法、噻唑蓝比色法(MTT法)等。MTT法有操作简单、实验精准度高、经济安全、重复性好的优势,目前广泛应用于抗癌药物的筛选。
MTT化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,可接受氢原子发生显色反应,活细胞中的线粒体具有琥珀酸脱氢酶,能够使外源性MTT还原成难溶性蓝紫色结晶物,此结晶物可溶于二甲基亚砜,应用酶标仪可在490nm波长检测其吸光值。死细胞无线粒体活性,不能形成结晶物。在一定细胞数量范围内,吸光值与活细胞数目成正比。因此,根据吸光值的高低可判断出活细胞数量。
细胞存活率=测试组吸光值/对照组吸光值×100%
具体操作步骤如下:
(1)收集对数生长期肿瘤细胞,制成含10%小牛血清的RPMI-1640单细胞悬液。调节细胞浓度为(1~10)×104/ml。
(2)按以下次序加入96孔培养板①40μl的1640培养基(无血清);②10μl检药物;③细胞悬液50μl(细胞密度为1000~10000/孔),共100μl/孔。边缘孔常可用无菌PBS填充。每组设3个平行孔,空白对照只加培养液。37℃,5%CO2孵育16~72h(视细胞种类及状态而定)。
(3)每孔加入20μl MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。
(4)离心(1000r,10min),小心吸掉上清,每孔加入100μl二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。
(5)在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。
同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。
注意事项:
(1)根据细胞的种类及状态选择适当的细胞接种浓度,使每孔1000~10 000个。以保证MTT结晶形成量与细胞数呈良好的线性关系。
(2)避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液,在加入MTT呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(3)设空白对照:空白对照不加细胞只加培养液,其他试验步骤保持一致,最后比色用空白孔调零。
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