抗真菌药物敏感试验

抗真菌药物体外敏感性试验（药敏试验）是测定病原真菌对抗真菌药物的敏感性，或者测定抗真菌药物对病原真菌的抑制活性的体外试验方法。抗真菌药物敏感试验方法建立在抗细菌药物敏感试验方法基础之上，但由于真菌是一种较高等的真核生物，其繁殖方式、生长周期和生长条件等均与细菌不同，因此抗真菌药物敏感性试验方法的规范化要比细菌困难。现有的抗真菌药物敏感性试验方法有标准化的微量液基稀释法、纸片扩散法及在此基础上形成的一些商品化方法。

一、微量液基稀释法

微量液基稀释法是抗真菌药物敏感性试验参考的标准方案（图1－18）。美国临床和实验室标准化研究所（Clinical　and　Laboratory　Standards　Institute，CLSI，以前为NCCLS）制定了酵母菌和产孢丝状真菌的微量液基稀释法抗真菌药物敏感性试验。该方法几经修改，其中酵母菌的药敏方案经历了M27－A、M27－A2，产孢丝状真菌经历了M38－A，并于2008年分别升级到M27－A3和M38－A2。该方案准确性高、重复性好，实验室间结果的一致性好，得到了公认。然而，该方法操作复杂，在临床推广难度较大。在这两种基础方案上，又产生了大量经济实用的商品化的药敏试验方法。

图1－18　微量液基稀释法抗真菌药物敏感性试验

（一）CLSI标准微量液基稀释法

由于酵母菌和产孢丝状真菌在生物学上的差异，其对抗真菌药物的敏感性也不同。CLSI分别制定了针对酵母菌和产孢丝状真菌的药物敏感性试验方案。

1．抗真菌药物的配制　药物来源为原料药粉，不能为商品化的药物制剂。抗真菌药物有水溶性和非水溶性两大类。氟康唑、氟胞嘧啶、棘白菌素类药物均为水溶性，用灭菌水溶解，过滤消毒；而其他唑类药物、两性霉素B等则用二甲亚砜（DMSO）溶解。配制好的药液存储在－60℃以下。CLSI　M27－A3中包括的受试抗真菌药物有酮康唑、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净。CLSI　M38－A2包括酮康唑、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、两性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬净、米卡芬净、阿尼芬净；其中棘白菌素类药物用于测定非皮肤癣菌；另外，还有灰黄霉素、环吡酮、特比萘芬，这三种药物用于测定皮肤癣菌。

2．受试菌株　M27－A3方案中包括的受试菌种仅包括念珠菌和新生隐球菌，不包括双相真菌的酵母相。M38－A2中包括的受试真菌为能引起侵袭性感染的曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利士霉、孢子丝菌等丝状真菌，以及引起皮肤真菌感染的皮肤癣菌（毛癣菌、小孢子菌、表皮癣菌）。药敏试验前，念珠菌在葡萄糖蛋白胨琼脂（SDA）培养基上35℃活化1天，新生隐球菌和阿萨希毛孢子菌活化2天；曲霉、尖端赛多孢在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上35℃活化7天；镰刀菌接种在PDA上，先在35℃，3天，再转到28℃，4天。皮肤癣菌要接种在PDA培养基上或燕麦培养基诱导孢子产生，30℃孵育4～5天或者植到好的孢子产生。

3．抗真菌药物敏感性试验的步骤　培养基为RPMI　1640液体培养基，以终浓度为0．165 mol／L的MOPS为缓冲液，调整培养基在25℃时pH　7．0±0．1。抗真菌药物的最终工作浓度：两性霉素B、唑类药物、棘白菌素类药物均为16～0．03μg／ml，FLC、氟胞嘧啶为64～0．125μg／ml。念珠菌、隐球菌用0．85%无菌盐水调成浓度为0．5McFarland；再将此菌悬液用RPMI　1640稀释1　000倍，接种终浓度为（0．5～2．5）×103个孢子／ml。产孢丝状真菌的悬液进行透光度测定孢子浓度，而后用RPMI　1640进一步稀释50倍，接种终浓度为（0．4～5）× 104个孢子／ml。皮肤癣菌接种终浓度为（1～3）×103个孢子／ml，所有真菌的孵育温度统一为35℃。

4．读取MIC的时间点　念珠菌、多数产孢丝状真菌在46～50小时，隐球菌在70～74小时，米根霉在21～26小时，尖端赛多孢在70～74小时。如果测试药物为棘白菌素类药物时，念珠菌在24小时读取结果。皮肤癣菌孵育4天或直到生长对照孔生长良好。

5．MIC值终点判读标准　两性霉素B的终点判定标准为肉眼观察到的无真菌生长的最低药物浓度。其他药物则因受试菌株和药物的不同而不同。对于氟胞嘧啶、唑类和棘白菌素类药物抗酵母菌时，终点为真菌生长明显受抑制的最低药物浓度。唑类药物抗丝状真菌（不含皮肤癣菌）时的终点则为肉眼观察到的生长完全受抑制的药物浓度。棘白菌素类药物抗丝状真菌时采用最低有效浓度（minimal　effective　concentration，MEC）的概念，即出现短而异常菌丝分枝的最低药物浓度。所有药物抗皮肤癣菌的终点判读标准均为肉眼观察到无真菌生长的最低药物浓度。

6．折点的判定　微生物对抗生素是敏感还是耐药的判断，主要是通过将试验得出的MIC值同确定的药折点（break　point）进行比较分析而得出，不同药物的折点有不同的标准。折点是根据抗菌药物抑制菌生长所需要的MIC。结合常用剂量时该药在人体内所能达到的血药浓度划分病原菌对各种抗菌药物敏感和耐药的界线。CLSI已制定出氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶、棘白菌素类药物抗念珠菌的折点（表1－7）。而其他药物抗酵母菌的折点以及所有药物抗产孢丝状真菌的折点仍未确立。

表1－7　抗真菌药物敏感性试验的折点判定

＊数据主要基于黏膜疾病

（二）欧洲微量液基稀释法

欧洲抗微生物敏感性测定委员会（European　Committee　for　Antimicrobial　Susceptibility Testing，EUCAST）推出的酵母菌微量液基稀释法的基本原理和方法同CLSI　M27－A3药敏方案，该方案为半自动化，其与CLSI方案的差异见表1－8。

表1－8　CLSI　M27－A3与EUCAST　E．Dis　7．1微量液基稀释法比较

（三）商品化的微量液基稀释法

市场上有多种以CLSI微量液体稀释法为基本原理的商品化方法。主要用于酵母菌的药敏试验。

1．Yeast　One　Sensititre　Yeast　One　Colorimetric　Antifungal　Panel（简称Yeast　One法）是在一次性干性96孔微孔板装有系列稀释浓度的被染色的抗真菌制剂和氧化还原指示剂在MIC终点能产生视觉可以辨认的明显的颜色改变。将该方法与标准的液体稀释法M27－A2相比，MIC符合率为97%～99%，而且可重复性好。由于简单、可靠，该试验2004年被美国FDA批准用于临床检测念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶的敏感性。Yeast　One法还可以用于新型抗真菌制剂泊沙康唑、雷夫康唑和伏立康唑等的敏感试验，并且还可以用于产孢丝状真菌的药敏性试验。

2．ATB　FUNGUS　3　ATB　FUNGUS　3（ATBF　3）是由生物梅里埃公司开发的一种商品化的酵母菌药物敏感性试验方法（图1－19）；该方法不但操作简便，而且判读结果的时间较早。ATBF　3药敏板由32个孔组成，包括5种不同浓度的抗真菌药物和2个生长对照孔，抗真菌药物倍比稀释。测试的药物有5种，包括氟胞嘧啶：16～4μg／ml，两性霉素B：4～0．5μg／ml，氟康唑：128～1μg／ml，伊曲康唑：4～0．125μg／ml，伏立康唑：8～0．06μg／ml。真菌孢子用0．85%无菌氯化钠溶液调整成浊度为2McFarland，取20μl的菌悬液加入到ATBF　3药敏试验专用培养基。混匀后，取135μl含菌悬液的培养基加入到ATBF3板上的各孔中。药敏板在35℃温箱中孵育，念珠菌在24～48小时，对照孔生长良好时对各孔生长情况进行评分。新生隐球菌在48小时，对照孔生长良好时对各孔生长情况评分。评分标准如下：与对照孔相比，生长无减弱评分为4分，生长有轻微减弱为3分，生长明显减弱为2分，非常弱的生长或周边生长为1分，拖尾生长为1～2分，无生长为0分。对于唑类药物和5－FC，评分为2、1、0分的最低药物浓度为MIC，而对于两性霉素B，评分为0分的最低药物浓度为MIC。

图1－19　ATB　FUNGUS　3药敏方法

二、E－test法

E－test法是琼脂扩散法的改良，该方法用含有梯度浓度排列的药液条置于涂布有一定量真菌的培养基上，通过两者形成的椭圆形抑菌圈，可判断药物的MIC值（图1－20）。本法操作简单，可重复性好，缺点是价格昂贵。目前市场上销售的E－test药敏纸条有两性霉素B、氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、卡泊芬净等。E－test基本操作步骤如下：RPMI－1640固体培养基以MOPS缓冲剂调节pH为7．0，加入2%的葡萄糖后，高压灭菌后倒入平皿，冷却凝固。比浊孢子浓度为0．5FcFland；用无菌棉签蘸取孢子悬液，将多余的液体经挤压试管壁而去除，并在平皿表面沿3个方向均匀涂布菌悬液，之后放置干燥15分钟；将E－test条小心放置于平皿表面，保证MIC刻度朝上，最后将平皿置于35℃，于48小时后读取结果。

图120　Etest药敏方法

三、纸片扩散法

纸片扩散法是将含有定量抗真菌药物的纸片置于接种定量真菌的平皿中，在一定温度下经过一定时间孵育后，通过测量抑菌圈的大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性。该方法简单直观，CLSI制定了M44－A标准化的纸片扩散法药敏试验方案；另外，已有用于纸片扩散法的商品化试剂。

（一）CLSI的M44－A方案

2004年，CLSI制定了M44－A酵母菌纸片扩散法敏感试验方案，此方法适用于所有的念珠菌属，方案制定了氟康唑和伏立康唑抑菌环折点解释标准。制备0．5号麦氏管菌悬液，将酵母菌悬液涂布于含葡萄糖和美蓝的Mueller－Hinton（M－H）琼脂上，35℃孵育18～24小时。M－H琼脂补充葡萄糖和美蓝，可促进酵母菌生长并且改善抑菌环边缘清晰度。补充物可直接加入M－H琼脂中或倾注已制备的M－H琼脂表面上，待补充物充分吸收到琼脂中，然后再涂布菌悬液（图1－21）。M44－A药敏方案中氟康唑和伏立康唑抗念珠菌的折点见表1－9。

图1－21　纸片扩散法

表1－9　纸片扩散法测定氟康唑、伏立康唑抗念珠菌的折点

﹡克柔念珠菌对氟康唑天然耐药，这里的敏感范围不适合用于解释克柔念珠菌得到的结果

（二）商品化的纸片扩散法

Neo－sensitab丹麦ROSCO公司研制的抗真菌药敏纸片，操作简单，结果直观，易于普及，主要适用于酵母样真菌的药敏试验。

四、药敏试验的质量控制

要保证药敏试验结果的准确性，必须要有一套可靠的质量控制。ATCC菌株对抗真菌药物的敏感性比较稳定，各种药敏试验时，常用这些菌株作为质控菌株。只有当质控菌株的对抗真菌药物的敏感性在质控范围之内，才能认为试验所得到的数据是可靠的。表1－10～表1－12是各种药敏方法ATCC菌株的质控范围。各种商品化的药敏方法也有各自的质控。

表1－10　微量液基稀释法皮肤癣菌质控菌株MIC范围

表1－11　微量液基稀释法质控菌株MIC范围

表1－12　纸片扩散法测定唑类药物抑菌环直径的质控范围