1．检验目的
对临床标本培养出的真菌进行抗生素敏感性试验，为临床合理用药提供依据，能够帮助临床医生为患者的治疗选择合适的抗真菌药物，也对监测耐药真菌的出现和耐药性变化趋势有重要意义。
2．试验方法
目前可用于检测抗真菌药物敏感性试验的方法有ATB-FUNGUS真菌药敏试验、纸片扩散法、液体稀释法和E-test方法。
3．实验原理
ATB（Authorritative、Typical、Broad权威、经典、全面）真菌药敏试验采用比浊和散射测浊的原理，估计细菌生长的密度，不同抗菌药物设置不同的阈值，以最低药物浓度达到细菌不生长或达到80%抑制生长为最低抑菌浓度。此条包括16对杯，2对不含有任何抗生素，可作为阳性生长的对照，其他每对含有不同的抗真菌剂，有的杯用于最低抑菌浓度的测定，要测的酵母悬浮在安瓿的悬液中，然后转到生长培养基中，接种到试验条中，培养24到48 h后，生长与否可用肉眼观察或用自动ATB记录仪，所得结果可归类成敏感、中度敏感或耐药。
4．方法及操作
4.1 ATB-FUNGUS真菌药敏试验：用于酵母样真菌。
4.1.1 首先从包装中取出试验条，菌株的参考材料可标在试验条的侧边；用单纯菌落在蒸馏水中植被酵母悬液，其浊度相当于2号McFarland的真菌悬液。
4.1.2 用加样器转100μl菌悬液到ATBF培养基的安瓿中，小心混合，避免有气泡形成。
4.1.3 再用ATB吸管均匀分配已接种过菌液的ATBF培养基，倒到第一部分试验条的每个杯内，每杯135μl，每个杯有104菌数。
4.1.4 将在管头中留下来的培养基放回安瓿中，以提高其pH，用已调好pH的培养基接种第二部分的试验条，每杯135μl。
4.1.5 加盖，并把试条放置30℃培养24～48 h。
4.1.6 结果判读：肉眼记录，置试验条于垂直位置，观察每管中可见生长物，记为“+”，不生长记为“-”；本试条中包括六种药物，即氟胞嘧啶、两性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑和酮康唑。对咪唑类（MIC、ECO、KET），会有残渣状的生长物，在这种情况时，应比较对照管的生长（表11-66）。
表11-66 ATB-FUNGUS真菌药敏试验
4.1.7 MIC测定：将试验条置于水平位置，降低浓度，读杯的结果，MIC是不生长的最后一个杯的值，记录结果于报告单。
4.1.8 自动记录结果：置试验条于ATB记录仪上，从计算机读结果。
4.1.9 质量控制
4.1.9.1 可选用ATCC推荐菌株同时试验，以保证结果的准确性。
4.1.9.2 所测试菌株必须是纯菌落。
4.1.9.3 严格按试剂盒内操作说明进行，菌液配制完应在15 min内接种完毕。
4.2 Etest方法：按试剂盒内操作说明进行。
4.3 丝状真菌的药敏试验方法
4.3.1 培养基：使用含有L-谷氨酰胺及酚红指示剂、不含碳酸氢钠的RPMI1640液，将10.4 g RPMI1640 药粉溶解于900 ml双蒸水，加MOPS（3-N-吗啡啉丙磺酸）使终浓度为0.165 mol，边加边搅拌至药粉溶解，用1 mol/L的NaOH调pH至7.0±0.1，加水至1 L，过滤灭菌后保存于4℃。
4.3.2 药物的溶解、稀释和储存：不同抗真菌药物选择相应溶剂，氟康唑、氟胞嘧啶用灭菌水溶解，两性霉素B、酮康唑、伊曲康唑使用二甲亚砜溶解。药物重量按其生物活性度计算：
重量（mg）=［体积（ml）×浓度（μg/ml）］/生物活性度（μg/mg）
4.3.3 菌液：将丝状真菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂斜面上于35℃生长7 d，用1ml无菌生理盐水冲洗斜面，获得分生孢子悬液，静置3～5 min，自然沉降粗大颗粒，取上层均匀混悬部分（即含有非芽生分生孢子或孢子囊孢子与菌丝的混合液）于无菌管，加盖，在漩涡震荡器上震荡15 s，用分光光度计测定530 nm的光密度值，曲霉为0.09～0.11，镰孢菌、根霉为0.15～0.17，再进行1∶50稀释成接种液。
4.3.4 接种孵育：取已倍比稀释抗真菌药物及真菌接种液各100μl，混匀，于35℃孵育21～26 h（根霉）、45～50 h（曲霉、镰刀霉）。
4.3.5 结果判读：将每一测试孔与生长对照孔比较，肉眼可见显著抑制真菌生长的抗真菌药物最低浓度为MIC。
0级：清亮或无生长；
1级：少量生长或为生长对照的25%；
2级：明显生长减少或为生长对照的50%；
3级：轻微生长减少或为生长对照的75%；
4级：生长未见减少。
两性霉素B和伊曲康唑少有拖尾，取0级为MIC，氟康唑、氟胞嘧啶和酮康唑应取50%生长抑制为MIC。
5．临床意义
随着感染患者广谱抗生素的广泛应用和器官移植患者免疫抑制剂的增加，真菌的感染率及严重性均趋于严重，导致临床患者的死亡率增高；同时，随着抗真菌药物的治疗增加，真菌对抗生素的耐药性也在增高，使得真菌的药物敏感性测定意义更加重要，为感染患者的个体化治疗提供依据；也可以进行连续监测及流行病学调查，为临床经验用药提供依据。
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