细菌的鉴定方法

细菌鉴定是通过细菌的形态特性、生化特性确定其分类地位的过程。与寄生虫相比，细菌形态较小，无法单纯根据菌体的形态进行细菌分类的，必须借助于更为精细的实验手段。细菌的生化特性是细菌分类和鉴定最重要的依据，现有的细菌分类系统就是按照细菌不同的生化反应而建立起来的。已经在细菌生化反应基础上建立了多种不同的细菌鉴定系统。近年来，随着分子生物学技术的发展，基于细菌基因序列的分子鉴定技术普遍用于细菌鉴定，细菌分类系统也作了较大调整。目前的细菌分类系统是基于形态、生化特性和分子序列基础上的，比起传统的细菌分类系统有了较大变化。随着对细菌研究的进展，细菌分类系统依然在不断的变化。

一、细菌的纯化和保藏

细菌的纯化和保藏是细菌鉴定中重要的技术保证。无论是传统的生化分类，还是近年来的分子分类鉴定，鉴定都必须针对纯的单菌落。同一环境中不同的分离株，可因生化性状存在差异，造成不同的细菌生化反应，影响细菌的鉴定；采用核酸序列分析的鉴定方法，也可因存在不同的核酸序列造成测序结果发生偏差或无法测通。细菌鉴定后，最为重要的是保藏致病菌株，用于后续的研究和分析。一般来说，致病菌株通常是水生动物病害重要的实验资源。熟练掌握细菌的纯化和保藏技术是水生动物病害研究的重要保证。

1.细菌的纯化

细菌的纯化是指从细菌群体中获得由某一种或某一株微生物的过程。水生动物病害感染中，除了优势的感染菌，可能存在其他细菌的继发感染；菌株实验过程中，存在因操作不当感染其他杂菌的可能，这些，都要求将菌株纯化，挑取出单一的菌落(单菌落)。

菌落是单个微生物在适宜固体培养基部生长、繁殖形成的肉眼可见细菌子细胞生长群体，许多菌落连成一片即成为菌苔。大多数细菌、酵母菌、许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落有稳定特征，是微生物分类、鉴定的重要依据。

实验室一般采用固体培养基平板划线法得到单菌落，再将单菌落转接到平板扩大培养，用于细菌的鉴定。基本操作为：用接种环无菌沾取少许待分离材料，在无菌平板表面连续划线，接种环上的微生物细胞数随着划线次数增加而减少，并逐步分散，经过正确的划线，到最后可得到单一菌落。需要说明的，有时的单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的。用于鉴定的菌株，一般要求经过多次平板划线，挑取单菌落再划线分离的过程，通常要求纯化 3～4次，以确保菌落为纯种。划线方法很多，容易出现单菌落的划线法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

对于平板上得到的单菌落，要仔细观察单菌落形态、颜色、大小、边缘、平凸、透明、是否湿润或干燥等菌落特征，同时结合染色镜检看菌体形态等，保证所鉴定的菌为纯种。已知病原要对照资料的描述来判断分离物是否与资料一致，如为新的分离株，要仔细记录有关特征。

对于采用划线法无法得到的单菌落的菌株，也可采用稀释法涂平板得到。某些具有迁移生长的细菌，菌落会长成一片，可采用加抑制剂的办法得到单菌落。对有些细菌，可采取选择性培养基分离单菌落。

2.细菌菌种保藏技术

菌种的保藏是微生物实验室常用的实验技术之一。细菌生长周期短，长期人为连续传代易引起苗种特性变异。因此分离苗种需要尽快保存，减少传代。各国均有相关的菌种保藏中心，我国的菌种保藏中心是中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），共设有6个保藏中心。菌种保藏的原则是既要方便使用，又要可能减少因传代产生的遗传变异。

常用的菌种保藏方法有：

（1）斜面保藏法

这是一种最基本的菌种保存方法，可适用于细菌、真菌及放线菌。微生物在适宜培养基斜面长好后，可在4℃左右保藏3～6个月。也可在长成的菌株斜面上加入无菌液体石蜡，预防培养基变干，延长保藏期。不同菌种保存期和保存时间不同，长的可达3～6个月，短的需1～2周传代一次。斜面保藏法的弊端是传代次数多了易发生变异，包括菌株毒力减退、性状变化等，也增加污染机会。

（2）半固体穿刺保藏法

此法是斜面保藏的改进，菌株用接种针穿刺半固体或软琼脂培养基的1/2处，菌株可在穿刺处及琼脂表面生长，菌株培养24～48小时后，覆盖2～3毫米无菌液体石蜡。本法操作简便，可用于保藏需气性或兼性厌气细菌、真菌、放线菌等，保藏效果好于斜面法。不同微生物种类保藏期长短和效果大有差异，有些真菌可可保藏10年之久，固氮菌、分支杆菌、沙门菌等不适宜此法保存。

（3）干燥保藏法

将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。多采用园土或耕作土研细、过筛、干燥、灭菌后使用；也可用沙子过筛后，以氢氧化钠和盐酸交替洗净后为保藏载体。为保证充分灭菌，沙土载体用经121℃高压灭菌2～3次。细菌可加入浓的菌悬液，真菌和放线菌可直接刮下孢子混和。加入菌液后小管需放入干燥器干燥，再经石蜡封口，置5℃保藏。这种方法适用于形成芽孢子的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。一般可保藏2年，有些微生物可长达10年。

（4）悬液保藏法

悬液法为将菌体悬浮于不含养分的溶液中，常用的有蒸馏水、0.25M磷酸缓冲液或生理盐水中，本法适于保存丝状真菌、酵母型真菌及肠道细菌等，可保藏1年以上。

（5）冷冻干燥保藏法

将保存菌种经冻冻干燥后保存的方法，可长期保存菌种，是目前大部分菌种保藏机构普遍采用的方法。一般待保存菌株用培养基培养至对数生长后期（一般为24～48小时），用冷冻分散保护剂洗下菌苔，制成均匀菌悬液（菌浓度109-10CFU/毫升）；将菌悬液滴到安瓿瓶中（0.1～0.2 毫升/支），冰冻后尽快进入冰冻干燥机中冻干；在抽真空条件下用喷灯熔封安瓿管，贴好菌株信息标签，保藏于4～5℃，一般可保存5～10年。

冷冻露干燥法保存的菌株活力与保藏过程中各个环节有关，其中冻干保护剂是较重要的一个因素。保护剂主要有氨基酸、有机酸、糖类等低分子化合物；或蛋白质、多糖等高分子化合物。美国菌种保藏中心（ATCC）采用马血清加入 7.5%葡萄糖，我国大多采用脱脂牛乳和血清。脱脂乳来源方便、离心脱脂后即灭菌即可使用，但灭菌温度过高将影响菌种保藏效果。

（6）低温保藏技术

菌种在低温下新陈代谢基本停止，可有利于长期保藏。液氮保藏法是早期应用较多的方法，液氮罐价格不高，用于保藏菌种，效果好、方法简单、保藏对象也最为广泛，通常将菌悬液加入冷冻保护剂后即可保藏，常用10%甘油或5%二甲亚砜为防冻保护剂。近年来，超低温冰箱在各实验室已经成为标准配备，采用-80℃的超低温冰箱也可很好地保藏菌种。一般超低温采用15%甘油的培养液保藏，保藏时间较长，适合于大量菌种的保藏。

二、细菌的形态学检查

通过分离培养获得的病原菌，必须达到不含有杂菌的纯培养程度，才能进行细菌鉴定。细菌鉴定是通过细菌形态、生化特征、抗原性等，鉴定其分类地位及型的过程。一般通过细菌的形态和生化特性可基本确定细菌的分类地位。

每种细菌形态在一定条件下有相对稳定性，但随着环境的变化，可使其产生不规则的变化。细菌形态鉴定应选用适宜的培养基和培养条件。形态学检查一般包括肉眼观察和显微镜观察。

1.肉眼观察

细菌菌体小于肉眼的分辨率，对细菌的肉眼观察主要是观察细菌固体培养基菌落形态、液体培养特性、半固体穿刺等观察。在固体培养基上，主要观察菌落大小、形态、颜色、表面光滑湿润、边缘整齐与否等；液体培养时，应重点观察培养物是否均匀混浊、管底有无沉淀、液面有无菌膜等；半固体穿刺主要观察细菌沿接种线的生长情况。此外，在鉴定性培养基中的菌落形态也是细菌鉴定的重要依据。

2.细菌染色和显微镜观察

显微镜观察主要观察菌体形态（杆状或球状）、运动性、革兰染色等染色特性、有无芽胞等。这些特性可对细菌进行初步的大类划分，如球菌、杆菌、成链状否等。

细菌染色有多种方法，与细菌鉴定有关的特性有革兰染色、芽孢染色、鞭毛染色、抗酸染色等。其中以革兰染色对细菌鉴定最为重要，根据细菌的革兰染色可将细菌分为革兰阴性和革兰阳性两大类，两类细菌的细胞壁结构不同造成染色特性不同，对抗生素敏感性也不同。

三、常用细菌鉴定方法

1.细菌生化鉴定原理及主要类型

细菌的生理生化特征与细菌的酶有关，也间接反映了细菌的基因组差异，生理生化特征比直接比较基因组要容易得多，因此生理生化特征对细菌的分类仍有重要意义。

细菌的生理生化特征主要包括细菌的营养类型、氮源利用种类、碳源利用种类、生长因子需要、温度适应性、代谢产物、对抗生素和抑菌剂的敏感性等多种性状。细菌代谢类型的不同本质还是与细菌分泌酶有关。常用的细菌生化鉴定指标有：

糖的分解试验 按细菌能分解糖的种类、产酸与否、是否产气等特性来鉴定。通常加入指示剂，如指示剂变黄，表明产酸。还可根据对糖的利用是需氧还是不需氧，可进一步分类。如假单胞菌需在有氧条件下利用糖，称为氧化型（彩图41），而气单胞菌则可在无氧状态下利用糖产酸，称为发酵型（彩图42）。

氨基酸脱羧试验 原理基本同上，也通过指示剂显色得知脱羧阳性或阴性。

吲哚试验 测定细菌利用色氨酸后产生吲哚与否。

2.细菌商品鉴定盒在细菌鉴定中的应用

商品性细菌鉴定系统的出现使得细菌鉴定专业性有所降低，也使得细菌鉴定能够在许多实验室或基层单位开展。商品性细菌鉴定的基本依据也是细菌的生理生化特征，所有的鉴定系统生产厂家已通过大量的菌株分离编制了细菌的数码分类鉴定手册，使用者只要通过将待鉴定细菌按一定浓度加入到鉴定条的各孔中，在规定条件下培养24～48小时，按说明书读取性状，即可根据细菌鉴定编码手册查出待鉴定细菌。

目前商品性细菌鉴定试剂均已实现微量化，并在水生动物病原分离和鉴定中取得良好应用。国内使用较多的有：浙江省军区检疫所研制（现称杭州天和公司）的细菌鉴定系统、上海市卫生防疫站发酵性革兰阴性杆菌鉴定系统SWF-A等。近年来国外细菌鉴定产品也在我国水生动物病害中获得广泛应用，主要有法国生物－梅里埃集团的 API-细菌鉴定条、美国的Biolog细菌鉴定系统、瑞士罗氏公司的Micro-LD、Minitek等。国外产品的价格要大大高于国内产品，但产品标准化、系统化程度较高，细菌鉴定编码库的菌株也较多，因此产品比国内更成熟、性能稳定，已经有替代国内产品的趋势。

现以法国生物－梅里埃集团的API20E为例介绍这类产品在细菌鉴定中的使用：

API 20E是国际上应用最多的细菌鉴定系统。共有20个用于鉴定的性状，分别置于20个分隔室，整体固定于一个塑料条上，每个分隔室为脱水细菌生化反应孔，可进行一种生化反应。鉴定时将菌液加至分隔室中，培养后观察记录反应结果。再根据检索表或通过电脑检索表，可知鉴定细菌分类地位。API 20E较适用革兰阴性杆菌特别是肠杆菌科细菌的鉴定，对于水产常见细菌有较好的鉴定效果（彩图43）。

除API 20E，梅里埃还提供其它16个产品，鉴定范围基本涵盖大多数常见细菌。梅里埃主要细菌鉴定产品如下表：

3.细菌生化性状检索数据库的建立和应用

目前所有的细菌生化鉴定对于数据的分析采用的是根据菌株生化性状编制的细菌鉴定程序，这类编码鉴定大大提高了细菌鉴定的简捷性和准确性。目前常用的微生物编码鉴定条除了梅里埃公司的API系列，还有Micro-ID、Rap ID、Enterotube和Minitek等系统。

目前的细菌鉴定结果已经不再是简单的菌株鉴定和定名，而是通过数学编码技术将每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索本。通过大量参考菌种库菌株的生化测定，建立细菌鉴定的检索数据库。在细菌编码检索本中，检索数据可提供几个主要结果：①根据数码值得出的1个或数个可能的菌名及相应的鉴定值；②对鉴定结果好坏的评价；③关键生化结果及阳性百分率；④鉴定结果不佳时可能出现多条菌名条目,并指出需进一步补充哪些试验项目才能得出良好的鉴定结果；⑤当鉴定结果不确定时，根据生化性状指出某些注意要点以及“推测性鉴定”和相应的参考实验室；⑥不能鉴定（无此鉴定数码值的可能原因）。这种鉴定系统的成熟为自动化细菌鉴定系统的开发打下了基础。

四、自动化细菌鉴定仪

1.自动化细菌鉴定仪/药敏分析系统的工作原理

基本微生物鉴定的自动化技术近年得到了快速发展。数码分类技术集细菌生化鉴定、计算机、自动化分析等为一体，通过标准化配套鉴定条和抗菌药物敏感试验条板，可快速准确地数百种临床常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。

现有的细菌自动化鉴定系统分为半自动和全自动两大类，半自动鉴定系统为人工加样鉴定条、人工孵育鉴定条、机器自动读数和统计鉴定结果。目前许多产品还同时具有药敏检测系统，可为细菌的药物治疗提供指导。

早期的生化反应通过对细菌对某一生化反应产物结束后的反应液中p H的变化，通过显色剂的显色来判断结果，再通过自动光电读数系统读取结果；近年来较多采用细菌分解底物后的p H变化，通过荧光原性底物酶解来判读结果的方法。

药敏试验分析系统是将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，通过测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。在含有抗生素的培养基中，浊度的增加提示细菌生长，根据判断标准解释敏感或耐药。

2.常见的半自动化细菌鉴定/药敏分析系统

（1）VITEDK-ATB半自动细菌鉴定/药敏分析系统

VITEK-ATB 是生物-梅里埃公司产品，由细菌生化鉴定结果读数器和检索鉴定的计算机两部分，计算机程序包括ATB和API细菌鉴定数据库、ATB药敏数据库、数据储存和分析系统及药敏专家系统。鉴定/药敏反应板机外孵育后，一次性上机读取结果，经计算机分析处理生成细菌鉴定和药敏结果报告。

（2）Auto Scan-4半自动细菌鉴定/药敏分析系统

Auto Scan-4是由Dade Micro Scan公司产品，由细菌生化鉴定结果读数器读数器和检索鉴定的计算机两部分计算机两部分组成。鉴定/药敏反应板在机外孵育后，一次性上机，自动判读鉴定和药敏试验结果；亦可人工判读结果和手工输入结果，再由计算机软件评定结果。有鉴定及鉴定药敏复合板两种测试卡。

（3）BBLTM Crystal TM半自动细菌鉴定系统

BBLTM Crystal TM 半自动细菌鉴定系统是BD公司产品，由细菌生化鉴定结果读数器读数器和检索鉴定的计算机两部分计算机两部分组成，采用荧光显色法。反应板机外孵育后，上机自动判读鉴定结果。

（4）Auto Reader半自动细菌鉴定/药敏分析系统

Auto Reader半自动细菌鉴定和药敏分析系统是Trek Diagnostic Systems LTD.产品，由计算机和读数仪等组成，采用荧光测定法。反应板机外孵育，上机读数，再软件评定测定结果，同时支持人工确认或全人工录入。

3.常见的全自动微生物鉴定/药敏分析系统

（1）VITEK 全自动微生物鉴定/药敏分析系统

生物-梅里埃公司生产，由计算机主机、孵育箱/读取器、充填机/封口机、打印机等组成，采用光电比色法显色，根据微生物分解后p H值，用指示剂显示的不同颜色来判断结果。每卡为30项生化反应。孵育中可由电脑控制读数器每隔1小时对各反应孔底物进行光扫描。一旦鉴定卡内的终点指示孔到临界值，则指示此卡已完成。最后一次读数后可将鉴定菌株的生物数码与菌种数据库标准菌生物模型比较，得到相似鉴定值并打印报告。VITEK可快速鉴定包括各种肠杆菌科细菌、非发酵细菌、苛氧菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌、厌氧菌和酵母菌等500种临床病原菌，并配备20多种药敏测试卡、97种抗生素和测定超广谱β-内酰胺酶测试卡，可快速检测细菌药敏情况。

VITEK-2是生物-梅里埃公司开发的新一代微生物分析仪，其工作原理与VITEK AMS没有大的差别，但它的容量更大，自动化程度更高，并且使用64孔的反应卡片，鉴定更准确可靠，可同时测定20种抗生素的药敏试验。

（2）Micro Scan Walk/ Away全自动快速细菌鉴定/药敏系统系统

Dade Micro Scan公司产品，由主机、真空加样器、孵育箱/读取器、计算机、打印机等组成。除采用传统呈色反应法外，同时支持敏感度更高的快速荧光测定技术来检测细菌胞外酶，提供普通板和快速板两种，普通板鉴定时间16～18小时，快速板仅2.0～3.5小时。现提供革兰阴性菌、革兰阳性菌、厌氧菌、酵母菌、嗜血杆菌和奈瑟菌等共8种鉴定，可鉴定近800种细菌。药敏部分采用比浊法进行测定，90%菌株可在5.5小时内获得对17～33种抗菌药物的MIC值。Walk/Away-40和96分别为可同时容纳40或96个测试板。

（3）PHOENIXTM全自动快速细菌鉴定/药敏系统

为 BD 公司产品，由主机、比浊仪、微生物专家系统等组成。该产品特色为采用了 BD专利荧光增强技术与传统酶、底物呈色反应相结合原理。药敏试验采用传统比浊法和BD专利呈色反应双重标准进行结果判断。有PHOENIXTM 100或50 二种型号，分别支持100个鉴定/药敏试验和50个鉴定/药敏试验。本系统可鉴定革兰阳性菌139种、革兰阴性菌158种。有鉴定板、药敏板或鉴定/药敏复合板3种供选产品，支持17种抗菌素5种浓度或28种抗菌素3种浓度的MIC药敏试验，细菌鉴定可在3～6小时完成，鉴定准确率大于90%，85%细菌药敏试验可在4～6小时完成。

（4）SENSITITRE（先德）ARIS全自动快速细菌鉴定/药敏系统

本产品为先德公司产品，由计算机主机、孵育箱/读数仪、全自动加样器等组成。培养箱可同时存放64块板，每块板可检测3个标本，故可同时检测192个菌种标本，采用荧光显色，支持人工判读结果。药敏试验有两种测定法，人工比浊法判定和仪器荧光测定法自动判读等。可在5小时内报告检验结果，支持革兰阴性菌、阳性菌、厌氧菌、苛氧菌及真菌鉴定等300多种抗菌药物不同组。

4.细菌自动化鉴定仪的局限性

（1）自动化鉴定系统是根据细菌鉴定数据库中资料鉴定细菌，数据库资料的不完整性将直接影响鉴定准确性。迄今尚无一个鉴定系统能包括所有的细菌鉴定资料。如著名的生物-梅里埃细菌鉴定系统中，就没有水产常见的哈维弧菌和海豚链球菌的鉴定资料，易造成这类菌株的鉴定错误。其他细菌鉴定系统也存在类似的缺陷。

（2）细菌的分类系统随着对细菌认识加深而不断演变，使用自动化鉴定仪实验室应经常与生产厂家联系，及时更新数据库。实验室技术人员应了解细菌分类的最新变化，便于在系统更新之前即可进行手工修改。

（3）通过自动化鉴定仪得出的结果，必须与其它已获得的生物性状（如标本来源、菌落特征及其它的生理生化特征）进行核对，以避免错误的鉴定。

五、其他细菌鉴定方法

除了根据细菌生理生化反应对细菌鉴定外，另外一类是根据细菌的气相色谱图进行的鉴定，这是根据细菌脂肪酸的气相色谱特征而设计的一种细菌鉴定方法。目前这方面做得比较好的仪器是安捷伦公司的MIDI Sherlock系统，通过采用气相色谱技术对微生物中特定的短链脂肪酸（C9-C20）进行分析和鉴定，再根据短链脂肪酸的种类和含量的图谱与内置的数据库进行比对，可实现对微生物种类的快速鉴定。目前该系统据称其菌株数据库已达2200余种，每个样品的鉴定时间仅为8～20分钟，可同时鉴定27个2毫升样品瓶该系统，且操作者不需要太多色谱知识和操作经验。

国内厂家近年来也开发了一些细菌自动化鉴定系统和相关的仪器设备，但用于细菌鉴定的试剂稳定性、设备设计合理性及分析用细菌数据库等与国外产品相比，均未达到理想程度。

六、细菌分子鉴定方法

细菌分子鉴定是根据细菌的保守基因序列的变异性对细菌进行鉴定的方法，分子鉴定近年来已经成为细菌鉴定的重要内容，许多公开发表论文中也将分子生物学鉴定作为细菌鉴定的一个重要指标。细菌的分子鉴定最大的优点是可以减少因表型差异造成的鉴定错误，随着各种鉴定序列在网络的公开，分子测定的参照体系日益完善，分子鉴定的正确性也日益提高。此外，分子鉴定还可充分利用不同作者发表的不同来源的细菌序列，进行相关关系分析，促进了对分离菌株的深层次认识。

细菌分子鉴定中目前使用最为广泛的是16S r RNA基因，又称16S r DNA。不同细菌16S r DNA 既含有高度保守的片段，又有中度保守和高度变化的序列区域，且分子大小适中，便于序列分析。适用于各种细菌16S r RNA通用引物的出现、PCR技术普及以测序成本下降，使得许多实验室可方便地获得细菌16S r RNA的序列，并通过Genebank上已知序列比较分析，方便地与已经报道的细菌进行分类比较。还可通过16S r RNA基因的序列设计特异性的引物，用于对特定病原细菌的PCR扩增和检测。

用于细菌分子鉴定的基因，除16S r RNA，还有16-23S ITS（插入序列）、HSP60基因（热休克蛋白基因）、grp B亚基基因（DNA解旋酶基因）等。可根据不同细菌保守序列的变异性不同，正确选择用于细菌分类定种的目的基因。