基于序列分析的细菌分类鉴定

实验十九　基于16SrRNA序列分析的细菌分类鉴定

一、实验目的

学习和掌握基于细菌的16SrDNA序列扩增测序、进化树构建的细菌分子分类鉴定方法。

二、实验原理

细菌的16SrDNA基因，在分子进化中非常保守，在一定程度上反映细菌的系统发生。所以，细菌的16SrDNA序列，经常与细菌的形态特征和生理生化特征结合，被用于微生物的鉴定及其分类地位的确定。微生物含有3个rRNA分子：23S，16S和5S，它们序列长度分别为2 900，1 540，120nt。其中16SrRNA分子量适中，含有较大信息量，碱基顺序保守性强且稳定，是鉴别生物间进化关系的重要分子，也是研究生物系统进化过程的分子钟。16SrRNA的序列分析表明它在种以上微生物相关性具有很高的分辨力。

三、实验器材

（1）菌株：耐辐射嗜热菌Anoxybacillus S1。

（2）培养基：胰蛋白胨10g／L，酵母提取物5g／L，NaCl 10g／L，琼脂20g／L，调pH值为8．0，121℃灭菌20min。

（3）主要试剂：EDTA缓冲液、SDS、NaAc、CTAB、酚－氯仿－异戊醇（25∶24∶1）、TE溶液、10×PCR buffer、6×Loading buffer、Mg2＋buffer、dNTP、DNA分子量标准、Taq DNA polymerase、RNase A、蛋白酶K、溶菌酶、核酸酶P1、无水乙醇、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、琼脂。

（4）试剂盒：UNIQ－10柱式通用DNA Purification Kit，EZ－10Spin Column PCR Product Purification Kit。

（5）细菌16SrDNA引物：27F：5′－AGAGTTTGATCATGGCTCAG－3′；1541R：5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′。

（6）分析软件：DNASTAR 7．1、MEGA 4．0和ClustalX 1．81，用于DNA序列的分析、同源性比较及系统发育树分析等。

（7）主要仪器：试管、三角瓶、量筒、天平、1．5mL微量离心管、PCR反应管、移液枪、电热恒温水槽、涡旋振荡器、pH计、压力蒸汽灭菌器、超净工作台、恒温调速回转式摇床、高速台式冷冻离心机、PCR仪、制冰机、低温冰箱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶扫描仪。

四、操作步骤

（一）细菌基因组DNA的提取

（二）菌体的获得

将耐辐射嗜热菌Anoxybacillus S1接种于灭过菌的培养基中，55℃，150r／min振荡培养24h，4℃，12 000rpm离心10min收集菌体。

（三）CTAB法抽提基因组DNA

（1）收集好的细菌培养物移至1．5mL无菌离心管中，加入1mL无菌水，12 000rpm离心5min，去除上清液；加入200μL无菌蒸馏水洗涤1次，4℃，12 000rpm，离心5min，然后去除上清液。

（2）加入200μL EDTA缓冲液，重新悬浮细胞，混匀，4℃，12 000rpm，离心10min洗涤，去除上清液；重复一次。

（3）用200μL EDTA缓冲液重新悬浮细胞，加入3μL溶菌酶溶液（20mg／mL），2μL RNase A溶液（10mg／mL），混匀，37℃孵育40min。

（4）加入3μL Proteinase K溶液（10mg／mL），37℃孵育60min。

（5）加入20μL 25%SDS溶液，65℃温育10min。

（6）加入45μL 5mol／L NaAc溶液和30μL 2%CTAB溶液，混合均匀。

（7）加入等体积的酚－氯仿－异戊醇（25∶24∶1），4℃，12 000rpm离心5min，得上清液。

（8）上清液转移至新的1．5mL无菌离心管中，重复（7）一次。

（9）取上清液，加入2倍体积的无水乙醇（预冷），混匀，－20℃下静置20～30min，4℃，12 000rpm，离心5min，轻轻去除上清液。

（10）沉淀加入1mL 70%乙醇溶液洗涤，4℃，10 000rpm，离心2min，重复一次，彻底去除上清液。室温下将沉淀物中残留的乙醇吹干，直至沉淀变成透明；加入50μL TE溶液溶解，－20℃保存备用。

（四）基因组DNA纯化

采用通用DNA Purification Kit，UNIQ－10柱。

（1）按每100μL DNA溶液加100μL Binding BufferⅡ，混匀，放置2min。

（2）全部转移到UNIQ－10柱，柱子放入2．0mL Collection Tube，室温放置2min后，10 000rpm室温离心30s。

（3）取下UNIQ－10柱，弃去离心管中的废液。将柱子放回同一根离心管中，加入500μL Wash Solution，10 000rpm室温离心30s。

（4）重复步骤（3）一次。

（5）取下UNIQ－10柱，弃去离心管中的全部废液。将柱子放回同一根离心管中，10 000rpm室温离心30s，以除去残留的Wash Solution。

（6）将柱子放入新的干净1．5mL离心管中，在柱子中央加入50mL Elution Buffer，室温放置2min，提高洗脱液的温度至55～80℃有利于提高DNA的洗脱效率。

（7）10 000rpm室温离心1min。收集管中的液体即为纯化的DNA，可立即使用或保存－20℃备用。

（五）基因组DNA的检测

采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的长度和纯度。

（1）灌胶模具的准备：将灌胶模具、梳子清洗干净晾干，然后调平灌胶板。

（2）琼脂糖胶的配制：先配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液1×TAE（母液为50×TAE），然后准确称取所需琼脂糖放入锥形瓶中，加入一定量的电泳缓冲液，用称量纸包于瓶口，于微波炉中熔胶至清澈、透明的溶液状。

（3）制胶：在熔好的胶中加入EB（溴化乙啶，终浓度为0．5g／mL）2～3滴，轻轻充分摇匀，待其冷却到50～60℃时倒胶，插入梳子，凝胶厚度一般为0．3～0．5cm，在锥形瓶中加入部分水，置于EB台上。

（4）凝胶：完全凝固后（于室温放置20～30min），在梳子齿附近加入少量电泳缓冲液，然后缓慢轻轻地向上拔掉梳子，把碎胶冲干净，将凝胶放入电泳槽中。

（5）电泳前的准备：在电泳槽中加入电泳缓冲液（1×TAE），使其恰好没过胶面约1mm。

（6）点样：加入DNA Marker，将上样缓冲液（6×Loading Buffer）和样品以1∶5的比例混匀点样。

（7）电泳：加好样后盖上盖子，打开电源，电压调至85V，电泳60min，在溴酚蓝指示距胶末端1／5胶长度时停止电泳。

（8）结果观察：将电泳后的凝胶放在凝胶成像系统中进行拍照观察。

（六）PCR扩增16SrDNA序列

（1）扩增的反应体系（50μL）

（2）依照下列程序进行PCR扩增：

采用细菌通用引物进行16SrDNA的PCR扩增。依照下列程序进行。

（3）扩增的DNA条带用2%的琼脂糖凝胶电泳检验。

（4）DNA经纯化及质粒连接后送样测序。所测序列用BLAST软件与GenBank和RDP数据库进行相似性分析，并与相关的亲近物种用MEGA 4．0软件包中的Neighbor－Joining法构建系统进化树。用p－Distance法，重复抽样1 000次分析系统树各分枝的置信度。

五、实验记录

（1）琼脂糖凝胶电泳成像图片。

（2）测序结果。

六、思考题

（1）为什么16SrRNA序列可用于细菌的分类鉴定？

（2）细菌DNA提取过程的注意事项有哪些？

参考文献

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