鼠疫菌的鉴定

第三章　鼠疫菌的鉴定

鼠疫菌鉴定可较全面地确定被试菌株的生物学特征，鉴定内容的重点应是菌属、种、型的各项指标。基本鉴定应有菌体形态、培养特性、营养需求、生化特性、毒力和毒子检查，以及菌型各项指标等检查。如有特殊要求，如非鼠疫耶尔森氏菌的鉴定，疫源地内分离的菌株同菌苗菌鉴别等，应选取有重要鉴别诊断和鉴定意义的项目进行检查。

1．观察原始材料、琼脂培养物、肉汤培养物及实验动物的涂片标本中的细菌形态和染色特征。

2．在营养琼脂平碟上的菌落形态特点，在肉汤中发酵。

3．在22℃半固体高层培养时有无动力。

4在22℃条件下是否被鼠疫噬菌体裂解。

5．糖、醇酵解试验

一般做阿胶糖、鼠李糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、蜜二糖、山梨醇、甘油、水杨素的酵解能力。

培基：于不含糖的培养基100ml（常用pH7．4～7．6蛋白胨水、牛肉膏液或胰酶消化液）加入1．6%溴甲酚紫酒精液0．1ml混合后呈紫色，121℃（15磅）20min灭菌。所需糖0．5～1．0g，充分混匀，分装于预先灭菌的小试管中，以113℃（8磅）20min灭菌，经无菌试验用。若无倒置管，可加适量琼脂做成半固体培基备用。

检查方法：将被试菌株分别接种于上述各种培基内，37℃培养7～14天，每天观察1次，或37℃培养7天于室温再观察7天，每天记录结果。选择已知菌种分别与各发酵管作对照；同时用各发酵反应管培基作空白阴性对照。

6．生化反应

（1）甲基红反应

0．02%甲基红酒精溶液：甲基红0．1g研溶于95%酒精300ml中，再加入蒸馏水至500ml。

Clark－Lubs培基：蛋白胨0．5g，葡萄糖0．5g，磷酸氢二钾0．5g，加蒸馏水100ml，每管分装10ml，121℃（15磅）20min灭菌备用。

方法：被试菌株接种于Clark－Lubs培基培养3～4天，滴加0．02%甲基红酒精溶液数滴，如呈红色即为阳性，黄色为阴性。

（2）V－P试验：被试菌株接种于Clark－Lubs培基培养4天后加入等量10%氢氧化钾溶液，混合后静置24h观察结果，如呈红色则为阳性，不显色为阴性。

（3）还原能力试验

第1液：氨基苯磺酸0．4g，加50ml 5mol／L醋酸（冰醋酸1份，加蒸馏水2．5份）。

第2液：α－萘胺0．25g，加50ml醋酸。

培养基：牛肉膏0．3g，蛋白胨0．5g，硝酸钾0．1g，加蒸馏水100ml，每管分装5ml，121℃（15磅）20min灭菌备用。

①硝酸盐还原试验（脱氮作用）：待试菌株接种培基孵育3～5天，加第1液0．1ml混合后再加第2液0．1ml，若显色，为阳性；若不显色，再加入锌粉少许，数分钟后若显粉红色或有氨味并有气泡产生都应定为阳性；若仍无上述反应则为阴性。

②硝化反应：待试菌株接种于3～5ml肉膏汤中，培养观察及检查方法同硝酸盐还原试验，但不显色后不需加锌，即可定为阴性。

（4）尿素酶检查

培基：蛋白胨1g，氯化钠5g，无水磷酸二氢钾2g，酚红0．012g，琼脂20g，加蒸馏水1000ml，pH校为6．9，每管分装4．5ml，121℃（15磅）20min灭菌，冷至50℃～60℃时，加入经113℃（8磅）15min灭菌的20%尿素水溶液（内含1%葡萄糖）0．5ml混匀，制成斜面备用。

方法：待试菌株接种于尿素培养基上，37℃培养1～7天，观察结果，鼠疫菌不能分解尿素，培养基原色不变。

（5）靛基质试验

第1液：对二甲氨苯甲醛4g，95%酒精380ml，浓盐酸80ml。

第2液：过硫酸钾饱和水溶液。

蛋白胨水：蛋白胨1g，氯化钠0．5g，蒸馏水100ml，每管分装5ml，121℃（15磅）20min灭菌备用。

方法：被试菌接种于蛋白胨水中培养3～4天，加入乙醚1ml，混匀，静止使其分层，加入第1液1ml，1min后如不变色再加入第2液1ml，乙醚层呈红色为阳性，否则为阴性。

7．鼠疫杆菌毒力决定因子检查法鼠疫杆菌的VW毒力抗原（VW）、抽出物F₁抗原、色素沉着因子（P）、鼠疫菌素Ⅰ（P1）、血浆凝固因子（C）、溶纤维蛋白因子（F）、嘌呤依赖（Pu）和鼠毒素（T）等，是近年来在研究鼠疫微生物学方面的一个新发展。它不仅关系到鼠疫菌的毒力免疫和病原性，而且在特异性诊断和菌株的分型上都有一定的意义。

这些因子，在决定鼠疫菌毒力方面是重要的，而又是相互不同地各自独立地存在着。每一个决定因子可以决定毒力的强弱和有毒力或无毒力，一般认为F₁、VW、P、Pu 4种与鼠疫杆菌的毒力关系最大，被称为毒力决定体。而其他与毒力有关的4种则称为毒力因子，把两者统称为毒力决定因子。鼠疫菌株之所以弱毒或无毒力，就是由于缺少一个或几个毒力决定因子。

（1）F₁检查：常用抗血清琼脂平板法。

平板制备：将不含任何防腐剂的抗鼠疫血清，其菌凝效价为1∶640～1∶1280的原血清1ml，以无菌手续加入已溶化冷至约45℃的100ml 2%溶血胰酶消化液琼脂（赫氏琼脂）中，充分混合后，倾注平碟，凝固后4℃保存备用。

方法：将待鉴定的菌株在37℃24h培养，用标准比浊管目测比浊，制成2000个菌／ml~ 3000个菌／ml菌液，用无菌吸管吸取0．1ml涂布于抗鼠疫血清琼脂于碟表面，置37℃培养2～3日，直到菌落直径达0．5～1．0mm。将平碟盖打开，放入数层纱布或棉花块，注加氯仿使达湿润程度，随将皿底翻扣入盖内静止约60s取出纱布或棉花，将平碟再置37℃24h后观察结果。凡菌落周围出现白色沉淀环者为F₁阳性菌株。

（2）VW检查

培基：2%赫氏琼脂100ml，0．25mol／L氯化镁（MgCl·6H₂O）8ml，0．25mol／L草酸钠（Na₂C₂O₄）8ml，1．0mol／L葡萄糖（C₆H₁₂O₆·H₂O）1ml，10%溶解兔血1ml。

先将氯化镁、草酸钠及葡萄糖水溶液分别113℃（8磅）15min灭菌，然后连同溶解兔血按量加入已灭菌并冷却至45℃～50℃的赫氏琼脂中，充分混匀，倾注平碟，凝固后4℃保存备用。

方法：将待鉴定的菌株24h斜面培养物，用无菌盐水制成10⁵菌体／ml的悬液，然后以无菌吸管吸取0．1ml血滴加于上述培基，每一被试菌株涂布2个子碟，1个置37℃培养，另1个置28℃培养，经72h观察结果，钙依赖VW阳性菌株将于28℃下融合生长，而在37℃培养仅有100个或更少的菌落生长。

（3）色素沉着因子（Pgm）检查

培基：先制成2%赫氏琼脂（pH7．6）100ml，加入1%刚果红溶液10ml，高压灭菌，冷至45℃～50℃，加入预先经113℃（8磅）15min灭菌的20%半乳糖溶液10ml，混匀，倾注平碟凝固后4℃保存备用。

方法：将待鉴定的菌株24h斜面培养物，用无菌盐水制成（2～5）×10³菌体／ml的悬液，然后以无菌吸管吸取0．1ml涂布于上述培基表面，置28℃温箱培养，48～72h观察结果，菌落呈均匀深红色为阳性，无色或72h后仅菌落中心显红色，判为阴性。

（4）鼠疫菌素Ⅰ（Pst1）检查

培基：胰化蛋白胨1g，琼脂粉0．8g，氯化钠0．5g，加去离子水100ml，121℃（15磅）20min灭菌后，分别加入预先经113℃（8磅）15min灭菌的1mol／L氯化钙、10%乙二胺四乙酸钠钙（EDTA－NaCa）各0．5ml，1mol／L葡萄糖1．0ml，10%溶解兔血1ml，混匀，倾注平碟，凝固后4℃保存备用。

方法：先将被试菌株接种（点种或划线）于培基平碟表面37℃孵育24h，同时把血清Ⅰ型假结核菌接种到4ml赫氏消化液培基中，28℃孵育24h。将平碟生长出来的菌落于吸有氯仿的纱布（5cm×5cm）上熏1min，再打开lmin，使氯仿蒸发掉。用无菌吸管吸取1ml28℃孵育24h的血清I型假结核菌液加入溶化并冷却至45℃～50℃琼脂（100ml）中，混匀后，分别倾注于经氯仿处理的平碟培养物表面上，使成为厚约2mm均匀薄层，待凝固后置37℃孵育24h、48h观察结果。在菌落或菌苔周围出现抑菌环且宽度大于2mm者为阳性，否则为阴性。

8．毒力测定鼠疫菌的毒力测定，选用动物要健康，常用豚鼠和小白鼠，一般以豚鼠为好。豚鼠要求体重为250～300g；小白鼠体重18g~20g。接种途径一般采用皮下，有时采用腹腔接种。接种菌量、剂量差及动物分组数量，应根据菌株的毒力而定。豚鼠注射量为0．5～1ml，小白鼠为0．2～0．5ml。菌株要求用普通琼脂或血琼脂37℃24h培养物。

测定最小致死量一般不用小白鼠而用豚鼠，但数量不得少于5组，每组不得少于5只。鼠疫菌毒力常用半数致死量（LD₅₀）表示，测定时，豚鼠不得少于5组，每组不得少于3只；小白鼠不得少于5组，每组不得少于10只，感染后饲养观察不得少于14天，累积死亡数（系指特异死亡，即在动物死亡后有鼠疫病理变化，同时分离到鼠疫菌）计算最小致死量和半数致死量。

半数致死量的测定，采用试验结果累计数统计，即各组的死亡数等于剂量小于本组的各组死亡数加上本组死亡数，计数死亡率，然后按下列公式计算：

LD₅₀＝Da＋X（50－Ma）／［（Ma＋1）－Ma］

Da：累计结果中死亡率低于50%的临界剂量，Ma：刚小于50%的死亡率，（Ma＋1）：刚大于50%的死亡率，X：剂量差

9．营养依赖型检查检查营养因子的方法很多，这里只介绍以Lawton基础培基为基础的减1种氨基酸的限定培基点种法。

Lawton基础培基：琼脂粉9．0g，双蒸馏水1000ml，加热溶化后加KH₂PO₄·3H₂O1．5g，溶解后用1moL／L NaOH调整pH到6．9，再加入MgCl·6H₂O 1．0g，113℃（8磅）蒸汽灭菌15 min。20%葡萄糖水溶液，113℃（8磅）蒸汽灭菌15min。

用前向溶化的每100ml基础培基中无菌实验条件下加入20%葡萄糖1ml，倾注平碟，备用。

减1种氨基酸的限定培基：向溶化的Lawton基础培基中，无菌加入20种氨基酸中的19种［每种氨基酸终浓度为10mg／L～25mg／L，氨基酸预先配制原液并经113℃（8磅）蒸汽灭菌15min］，使每1种琼脂平碟都缺少1种不同的氨基酸。

方法：接种方法有多种，这里只介绍点种法。先将被试菌制成10⁷个菌／ml～10⁸个菌／ml的菌悬液，取少许菌液点种于Lawton基础培基和含不同氨基酸成分的20种“减1种氨基酸的限定培基”上，28℃培养2～3天。不生长的平碟中缺少的那种因子，就是被试菌的依赖因子。如果研究对生长因子的精确需求，采用定量法；如果样本量大，可采用影印法，这些方法可查阅有关文献。

10．质粒及突变基因组的检测，包括生物芯片、PCR扩增、脉冲场电泳（PFGE）和插入序列（IS100、1541、285）检测等。鼠疫菌PCR扩增检测中至少F₁和Pla两个特异性基因片段扩增成阳性、同时反向血凝或胶体金—抗原检测成阳性也可确诊，但同时必须两个以上的平行实验室检测结果相一致。其中鼠疫菌脉冲场电泳（PFGE）和插入序列（IS100、1541、285）的分析可作为鼠疫分子流行学研究的基础。

11．激光散射仪在鉴定鼠疫菌中的应用一种“激光散射仪”能在细菌菌落繁殖数小时后对它们加以鉴别。散射仪包括一个激光二极管、一块屏幕、细菌培养皿、计算机和数码相机。研究人员首先在细菌培养皿中将细菌标本培养数小时，然后对各类细菌菌落进行生物化学分析，以检测这些细菌群中是否有危险种类。用激光束轰击细菌时发现，不同种类的细菌菌落都可以将激光散射成独特图案，类似于人的指纹。将这些图案投射到放置在培养皿后面的屏幕上，并用数码相机记录下来。通过对成像进行分析，可以自动鉴别出不同的细菌。散射仪分析软件在“认识”一种细菌散射图案后，今后遇到这种细菌就能自动识别。研究人员计划下一步建立相关数据库，以提高散射仪对细菌的自动识别能力。