高效液相色谱测定

HPLC是色谱分析法的一个分支，在经典液相色谱法和气相色谱法的基础上发展起来的新型分离技术，从分析原理上讲，其和经典的液相色谱法没有本质上的区别，但由于它采用了新型的高压输液泵、高灵敏度的检测器和高效微粒固定相，而使一度发展停滞的经典液相色谱法焕发出新的活力。尤其是近些年来电子计算机技术的引入，极大提高了仪器的自动化水平和分析精度，使得现在的HPLC在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面都可以和气相色谱法相媲美。综而观之，HPLC具有分离效能高、选择性好、检测灵敏度高、分析速度快等特点。正是因为它具有这些优点，治疗药物浓度的监测95%以上的文献都采用HPLC。

一、高效液相色谱的基本知识

（一）色谱法常用的术语和参数

1．域宽度 是色谱流出曲线中很重要的参数，它的大小反映色谱柱或所选色谱条件的好坏，常用半高峰宽（Wh／2）、峰宽（w）、标准偏差（d）表示，是衡量柱效的参数之一。在一定的条件下，区域宽度越大，柱效越低。

2．保留值 是死时间（to）、死体积（v0）、保留时间（tR）、调整保留时间（t′R）、保留体积（VR）、调整保留体积（V′R）等参数的总称，是色谱分析的定性参数。其中保留时间是指从进样开始到某个组分的色谱峰顶出现的时间间隔；死时间是指不被固定相保留组分的保留时间。两者之差则为调整保留时间。而保留体积则是指由进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时所需流动相的体积。死体积则是指由进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间，以上两者之差即为调整保留体积。

3．理论塔板数（n） 是取决于固定相种类、性质、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用的物质的一个衡量柱效的参数，可由色谱峰的保留时间和区域宽度计算，通常由下式求得。

4．分配系数（K） 是指在一定的温度时，达到平衡后，被检定组分在固定相中的浓度（CN）和在流动相中的浓度（CM）之比。在条件（流动相、固定相、温度等）一定，浓度很稀时，K只取决于被检定组分的性质而与其浓度无关。

5．量因子（k） 是指在一定温度下达到分配平衡后，被检测组分在固定相中的量和在流动相中的量的比例，如下式。

6．分离度（R） 是指相邻两峰分开的距离与平均峰宽的比值，是表示方法选择性大小的一个参数，可用下式计算。

当R＝1时，两峰基本分开；当R≥1．5时两峰完全分离。其影响因素涉及色谱柱的柱效、柱的选择性和色谱柱的容量等。

（二）HPLC的基本理论

1．塔板理论 色谱过程是物质在相对运动着的两相间连续分配平衡的过程。塔板理论把色谱柱看成一个分馏塔，把组分在色谱柱内的分配过程看成在分馏塔中的分馏过程，即把组分的色谱过程分解成在塔板间隔内的分配平衡过程。

2．速率理论 是一种色谱动力学理论，它把色谱过程看作是一个动态非平衡过程，研究色谱过程中的动力学因素对峰展宽或柱效的影响。它指出：在高效液相色谱中，溶质在色谱柱中的谱带扩展是由涡流扩散、分子扩散和传质阻力三方面的因素所决定。

（三）HPLC的分类和原理

1．吸附色谱 用固体吸附剂作固定相，以不同极性的溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的不同分离分析组分。

2．分配色谱 用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性的溶剂作流动相，依据样品中分析组分在固定液中分配性能的差别实现分析组分的分离。当固定相的极性大于流动相的极性时，则称为正相分配色谱，反之则为反相分配色谱。

3．离子色谱 用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH的缓冲溶液作为流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现对物质的分离。

4．体积排阻色谱 用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别分离分析组分。若以水溶液作为流动相则称为凝胶过滤色谱，若以有机溶剂作流动相则称为凝胶渗透色谱。

5．饱和色谱 以在不同基体上键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同pH的缓冲溶液作为流动相，依据生物分子与基体上键联的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。

（四）HPLC的基本方法

1．定性分析方法

（1）色谱鉴别法：依据同一物质在相同色谱条件下保留时间或保留体积相同而对组分进行定性分析。此法只适用于已知范围的未知物。

（2）化学鉴别法：先进行色谱过程后利用专属的化学反应对收集的组分进行定性分析，此种方法只能鉴别组分属于哪一类化合物。

（3）光谱鉴别法：即将色谱和光谱分析技术如质谱等联用而得到样品分析的定性、定量信息，是当今的一种重要分析方法。

2．定量分析方法 在HPLC分析中，在一定的分析条件下，样品中各组分的量或浓度与色谱峰高或色谱峰面积成正比。在实际工作中，因为测量峰高的干扰因素较少而常用峰高作为定量分析参数。常用的定量方法有外标法、内标法和内加法。

（1）外标法：用与待测组分同质的标准品作为对照，以对照品的量对比求算试样含量的方法。

（2）内标法：它是选择适宜的物质作内标物，以待测组分和内标物的峰高比或峰面积比求算样品中试样的含量。这种方法的关键是选择合适的内标物，即内标物应该是样品中不合的物质；高纯度；与待测组分的理化性质相近；与样品组分能完全分离；保留时间与待测组分相近。

（3）内加法：又称叠加法，这种方法是将待测组分的纯品加至待测样品溶液中，测定增加纯品后的溶液比原样品溶液组分的峰高或峰面积的增量。

（五）高效液相色谱仪组件

高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能各异、应用范围也不相同，但其基本组件是相似的，均包括以下几个主要部件，即储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理装置。有的仪器还有梯度洗脱装置。

（六）HPLC分析条件的选择

在色谱分析中如何选择最佳的色谱操作规程条件以实现最理想的分离，目前还未找到完全优化的参数组合。分析条件的选择包括固定相、流动相、洗脱方式、检测器等的选择。下面给出一些大的选择原则供大家参考。

1．现代液－固吸附色谱法通常采用粒度为5～10μm的全多孔硅胶为固定相。在选择硅胶作固定相时应主要考虑夺胶的比表面积、平均孔径和含水量。对于其流动相则主要硅胶作固定相时应主要考虑夺胶的比表面积、平均孔径和含水量。对于其流动相则主要考虑其溶剂强度、溶剂的选择性、溶剂的纯度和含水量。

2．化学键合相色谱法的固定相的选择则视试样的极性大小而定。分离中等极性和极性较强的化合物宜选择极性键合相，反之选择非极性键合相。对于其流动相的选择，正相键合色谱通常采用烷烃加极性调整剂，反相键合相色谱则通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水反应的极性调整剂。流动相的pH应控制在2～8。

3．反相离子对色谱要求尽可能采用表面覆盖度而且疏水性强的键合相、离子对所带的电荷与试样离子的电荷相反、流动相的pH应控制在2～8，常采用甲醇－水或乙腈－水系统作流动相等。

4．在分析组分多、性质相差较大的复杂样品时必须采用梯度洗脱，使所有组分在适当的条件直得到分离。

5．HPLC常用的检测器有紫外吸收检测器（UVD）、折光指数检测器（RID）、电导检测器（ECD）和荧光检测器（FD），但这些检测器都不是通用性的，因而要根据所检定的组分的性质对检测器进行适当的选择。没有通用的检测器是高效液相色谱技术中的一个弱点，近年出现的蒸发激光散射检测器（ELSD）有望解决这一问题。

6．HPLC专家系统是指一个具有大量HPLC分析方法专门知识和专家实践经验相结合的计算机程序，通常包括知识库、谱图库、数据库、推理机和人机对话界面。

二、HPLC方法建立的一般步骤

采用HPLC对未知样品进行分离分析，一方面，可以用多种HPLC方法；另一方面，一种HPLC方法不能解决所有样品的分析问题。因此，当对一个样品进行分析时，需要对所采用的方法进行审慎研究，实验室的条件、对液相色谱理论的理解、对他人经验的正确借鉴，以及分析工作者自身的实践经验都会对分析方法的建立产生重大影响。一般来讲，在分析样品确定以后，通常采取如下步骤建立适当的分析方法。

1．根据样品的溶解性质、样品的分子量范围以及样品的分子结构和分析特性选择适当的色谱类型和样品前处理方法（包括样品的匀化、去蛋白处理、组分的提取和样品的衍生化等）。

2．选择一根适当的色谱柱，确定柱的规格（包括内径和柱长）和选用固定相（包括粒径和孔径）。

3．应用HPLC理论选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法。

4．根据分析目的确定对色谱图是进行定性还是定量分析。

总之，所选择的方法应适用、快速、准确，并能满足分析目的的需求。

三、结核病治疗药物的分析

（一）INH

制剂或生物样品中INH的测定通常可采用反向高效液相色谱方法（RP－HPLC）。通常使用ODS柱，以甲醇－甲酸盐或醋酸盐作为流动相。若使用C18－CN或C18－phenyl柱，则分离效果更为理想。流动相中加入磷酸四丁基氨则可增加其容量因子和与内源性干扰物的分离度。生物样品中INH的检测最好使用电化学检测器。

1．色谱条件

（1）色谱柱：LC－CN柱（250mm×4．6mm，5μm）。

（2）流动相：异丙醇－水（5∶95，内含5g／L甲酸铵）。

（3）流速：1．0ml／min。

（4）检测：电化学，工作电位0．8V。

2．样品测定 取血浆25μl，加10%硫酸锌溶液150μl，涡旋混合，离心1min，取上清液350μl，加甲醇100μl，混合，离心，取上清液5μl进样，电化学检测。保留时间4．4min。

3．线性范围 2～10μg／ml，检测限0．1μg／ml。

（二）RFP

血清中RFP可以采用较为简便的蛋白沉淀反向HPLC分析。

1．色谱条件

（1）色谱柱：Radial－pakC18柱。

（2）保护柱：Quard－pakC18柱。

（3）流动相：乙腈／0．01mol／L乙酸钠缓冲液（pH7．0）（320∶620）。

（4）流速：2．0ml／min。

（5）检测：紫外，340nm。

2．样品测定 取血清25μl，加内标溶液（1μg／ml对硝基酚甲醇溶液）125μl，混匀，沉淀蛋白。静置5min，经每分钟10 000转离心5min，取上清液90μl进样。保留时间为内标物3．5min，RFP6min。

3．检测限 40μg／ml。

（三）PZA

采用RP－HPLC，通常以缓冲液为流动相或在缓冲溶液中加入少量的有机试剂甲醇或乙腈。生物样品可采用蛋白沉淀后溶剂提取，血浆样品测定的洗脱常采用梯度洗脱。

1．色谱条件

（1）色谱柱：LiChroCart RP－8柱（250mm×4．6mm，5μm）。

（2）保护柱：RP－8（50mm×4．6mm，10μm）。

（3）流动相：乙腈／10mmol／L磷酸盐缓冲液（pH3．5）（1∶9）。

（4）流速：1．5ml／min。

（5）柱温：（25±1）℃。

（6）检测：紫外，215nm。

2．样品测定 取血浆0．2ml，加内标溶液（12．5μg／ml对乙酰氨基酚甲醇溶液）8μl，甲醇200μl，0．2%维生素C溶液（含1mol／L磷酸二氢钾）1ml。调节pH4．2，加二氯甲烷－乙醚（2∶3）提取两次，每次7ml，振荡15min，离心10min，合并提取液，45℃水浴“蒸干”，残渣加甲醇50μl，涡旋溶解30s，取60μl进样。保留时间为内标物3．9min，PZA2．9min。

（四）PAS

对氨基水杨酸（PAS）HPLC分析的文献报道较少，大多与其他药物同时测定。一般采用梯度洗脱RP－HPLC测定血中的对氨基水杨酸钠。

1．色谱条件

（1）色谱柱：LiChrosorb RP－8柱（250mm×4．6mm，5μm）。

（2）保护柱：LiChrosorb RP－8柱（50mm×4．6mm，30μm）。

（3）流动相：①10mmol／L磷酸盐缓冲液（pH3．5）；②乙腈／10mmol／L磷酸盐缓冲液（pH3．5）（60∶40）。

（4）梯度：①0～5min，10%～80%；②5～15min，80%。

（5）柱温：25℃。

（6）流速：1．5ml／min。

（7）检测：紫外，215nm。

2．样品测定 取血清0．5ml，加内标溶液（1mg／ml对乙酰氨基苯甲酸甲醇溶液）10μl、甲醇220μl、1mol／L磷酸盐缓冲液（含2%维生素C）1ml，混匀，用1mol／L盐酸溶液调节pH4．2，用二氯甲烷－乙醚（3∶2）提取2次，每次7ml，振荡混合10min。离心，分取上层有机相，于45℃水浴中氮气流下吹干，残渣加甲醇75μl，涡旋溶解30s，置冰浴中，取25μl进样。保留时间5min。

3．线性范围 5～100μg／L。

（刘　泓　李东军）

参考文献

［1］熊礼宽．结核病实验诊断学．北京：人民卫生出版社，2006：201－320

［2］熊礼宽．结核病实验室诊断及其进展．北京：中国科学技术出版社，1992：219－248

［3］郭钧．结核病细菌学．沈阳：辽宁科技出版社，1983：194－237