高效液相色谱法测定发酵液中腺苷含量

高效液相色谱法测定发酵液中腺苷含量

张天瑞¹　刘淑云¹　陈宁^1，2

（ 1.天津科技大学生物工程学院　天津　300222；2.天津市工业微生物重点实验室　天津　300222）

摘要：采用反相高效液相色谱法对发酵液中的腺苷进行定量分析。采用Kromasil C₁₈色谱柱（250mm×4.6mm，5μm） ，流动相为磷酸盐缓冲液（pH6.5） -甲醇（85∶15） ，检测波长260 nm，流速0.8ml/min，柱温30℃。结果表明，RP-HPLC法测定浓度在0.108～1.08μg时线性关系良好，回归方程为Y=3684.4X-15.641，r=0.9997 ，平均回收率为98.45 %，RSD=0.97% （n=6） 。高效液相法快速、准确、重现性好，适合于发酵液中腺苷的定量分析。

关键词：腺苷；反相高效液相色谱；测定

腺苷（adenosine）即腺嘌呤核苷，是一种重要的药物及医药中间体。主要用于治疗心律不齐等症，还可合成多种药用核苷类物质，如治疗恶性肿瘤药物8-氯腺苷；具有生物活性的三磷酸腺苷（ATP） 、腺苷酸、阿糖腺苷等^[1]。

腺苷的生产主要有RNA降解法、化学合成法和发酵法，其中以采用糖质为原料直接发酵生产腺苷的成本最低^[2]。目前，国内已选育出了具有一定生产能力的菌株^[3～4]，因此对发酵液中腺苷产量进行有效的测定，是控制发酵产品质量的有效手段。在参考有关文献的基础上^[5～6]，本文对用反相高效液相色谱法测定发酵液中腺苷的含量进行了研究。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂

Agilent高效液相色谱仪，Agilent1100四元泵，Agilent1100VWD紫外检测器，Agilent化学工作站。腺苷标准品（天津联星生物试剂公司） ；发酵样品由本实验室制备；甲醇为色谱醇；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

1.2　测定条件

1.2.1　色谱条件

色谱柱： Kromasil C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm，天津市琛航科技仪器有限公司） ；流动相：磷酸盐缓冲液（pH6.5） ，甲醇（85∶15） ；检测波长： 260 nm，流速： 0.8ml/min，柱温： 30℃。

1.2.2　标准溶液配制及发酵样品预处理

精密称取腺苷标准品10.80 mg，置100 ml量瓶中，加水并稀释至刻度，摇匀，制成0.1080mg/ml的标准溶液。

取一定量的发酵液，沸水浴10min，4000r/min离心10min，取上清液，稀释50倍，经0.45μm的微孔滤膜过滤，备用。

2　结果

2.1　流动相的选择

分别配制（1）甲醇∶磷酸盐缓冲液（pH6.5） = 15∶85，（2）甲醇∶水= 15∶85 ，（3）乙腈∶水= 6∶94的溶液作为流动相，进行发酵样品的检测分析。结果表明甲醇∶磷酸盐缓冲液（pH6.5） = 15∶85的系统效果较好，发酵液中的杂质不干扰测定，理论塔板数以腺苷峰计不低于2000。

2.2　标准品及样品的分离色谱图

取标准品和样品溶液，在上述色谱条件下，各进样20μL，测得标准品及样品的色谱图见图1。

图1　腺苷标准品（A）和样品（B）液相色谱图

2.3　线性实验及最低检测限

取1.2.2中配制好的腺苷标准溶液，分别将其稀释，得到浓度分别为0.0540、0.0432、0.0324、0.0216、0.0108和0.0054mg/ml的标准溶液。吸取上述溶液各20μl进样，记录色谱图。以标准品进样量（X，μg）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=3684.4X-15.641，r=0.9997，表明腺苷在0.108～1.08μg范围内呈良好的线性关系。用线性实验中的质量浓度为0.0054mg/ml的腺苷标准样进样，进样量为5μl时，响应信号约为噪声信号的3倍，即最低检测限量为27ng。

2.4　精密度试验

取质量浓度为0.0324 mg/ml的腺苷标准溶液20μl，在1.2.1所述色谱条件下重复进样6次，测定峰面积，计算腺苷的RSD为0.57%，精密度较好。

2.5　回收率试验

采用加样回收法，取已知含量的发酵液六份，分别精密加入腺苷标准品适量，混匀，按1.2.2项操作，分别进样，测定腺苷的回收率，结果见表1。

表1　腺苷的回收率试验结果

2.6　样品测定

分别取3个批次的发酵液，按上述方法测定，结果见表2 。

表2　发酵液样品测定结果（n=3）

3　结论

腺苷的测定方法有纸层析法、离子交换法、高效液相法，以纸层析法应用的最为广泛。但发酵液中成分复杂，纸层析方法分离的斑点不易辨认，发酵液中有一些有紫外外吸收的物质不能有效分离，使测定值偏高。本文表明应用RP-HPLC可有效的定量分析发酵液中的腺苷含量，该法灵敏度高，重现性好，是一种比较理想的定性定量检测方法。

参考文献：

[1]袁亚峰，孙莉，裴文.腺苷合成研究进展.合成化学，2003，11 （4）:307～309

[2]施庆珊，许虹，林小平，邱玉棠.腺苷的合成与应用.精细品与专用化学品，2004.12 （19）:12～15

[3]施庆珊，林小平，许虹，李良秋，邱玉棠.腺苷生产菌Xn151菌种选育的研究.广东药学院学报，2005，21

（2）:174～177

[4]柏建新，邓崇亮，朱晓宏，张一平，杜郭君，王红连.肌苷菌核酸代谢关键酶缺失和形成选育腺苷菌的研究.微生物学通报，2003，30 （2）:52～56

[5]霍东方，钱婷，林远声.高效液相色谱法测定腺苷.中山大学学报论丛，2002，22 （1）:232～235

[6]李慧义，周铁玲，王静，徐康森.HPLC法测定腺苷及其有关杂质及分析物保留行为与流动相性质关系研究.中国药学，2000，9 （2）:84～87