高效液相色谱

3.9.5　高效液相色谱

高效液相色谱法在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论；在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9×10⁷　Pa）；色谱柱以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。

一、特点

1.高压

液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。压力一般可达15～35MPa。

2.高速

流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10mL／min。高效液相色谱法所需的分析时间较经典液相色谱法少得多，一般少于1h。

3.高效

近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。

4.高灵敏度

高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器的最小检测浓度可达0.1ng／mL。另外，用样量小，一般几微升。

5.适应范围宽

不妨将气相色谱法与高效液相色谱法进行比较。气相色谱法虽具有分离能力好、灵敏度高、分析速度快、操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子质量大（400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%），原则上都可应用高效液相色谱法进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的占70%～80%。

二、高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述主要类型。

1.液－液分配色谱法

液－液分配色谱的流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：

式中：c_s为溶质在固定相中的浓度；c_m为溶质在流动相中的浓度；V_s为固定相的体积；V_m为流动相的体积；K为分配系数；k为分配比。

液－液分配色谱法（LLPC）与气相色谱法（GPC）有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。

液－液分配色谱法分如下两种：正相液－液分配色谱法（Normal Phase Liquid Chromatography），其流动相的极性小于固定液的极性；反相液－液分配色谱法（Reverse Phase Li －quid Chromatography），其流动相的极性大于固定液的极性。

液－液分配色谱法的缺点有：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力会造成固定液流失。20世纪70年代末发展的化学键合固定相，可克服上述缺点。

2.液－固色谱法

液－固色谱法的流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。该色谱法是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S）。可表示如下：

式中：X_m为流动相中的溶质分子；S_a为固定相中的溶剂分子；X_a为固定相中的溶质分子；S_m为流动相中的溶剂分子。

当吸附竞争反应达平衡时，可用下式表示：

式中：K为吸附平衡常数。

3.离子交换色谱法

离子交换色谱法（IEC）以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子与交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法进行分离。

4.离子对色谱法

离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：

式中：为流动相中待分离旳有机离子（也可是阳离子）；为流动相中带相反电荷旳离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；为形成的离子对化合物。当达平衡时：

根据定义，分配系数为：

D_X＝［X^＋Y^－］_有机相／［X^＋］_水相＝K_XY［Y^－］_水相

离子对色谱法（特别是反相法）解决了以往难以分离旳混合物旳分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等的分离。

5.离子色谱法

离子交换色谱法以离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器为通用检测器。为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。

以阳离子交换树脂（R—H）作固定相，分离阴离子（如Br^－）为例。当待测阴离子Br^－随流动相（NaOH）进入抑制柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：R^－－H^＋＋Na^＋OH→─^－R^－－Na^＋＋H₂O R^－－H^＋＋Na^＋Br→─^－R^－－Na^＋＋H^＋Br^－

可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br^－则被转化成了相应的酸H^＋Br^－，可用电导法灵敏地检测。

离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。

6.空间排阻色谱法

空间排阻色谱法以凝胶（gel）为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。

三、高效液相色谱系统组成

高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将分别叙述其各自的组成与特点。

1.进样系统

一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品的重复性是有益的。

2.输液系统

该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪3部分。高压泵的一般压强为14.7～44MPa，流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相贮存器和梯度仪可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子强度、pH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的差别或是同分异构体）都能获得有效分离。

3.分离系统

该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱长度一般为10～50cm（需要两根连用时，可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料制成，柱内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）。固定相中的基质是由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去）、多孔性和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基团（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分辨率的道理。

再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60℃，通过改善传质速度，缩短分析时间，就可增加层析柱的效率。

4.检测系统

高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器3种。

1）紫外检测器

该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点为：使用面广（如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10－10　g／mL）；线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。

2）示差折光检测器

凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为10^－7　g／mL），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用于梯度洗脱样品的检测。

3）荧光检测器

凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10－12　g／mL或10－14　g／mL），痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用。

5.数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。