一、目的及要求
1.理解液相色谱的原理与应用。
2.掌握用保留值定性及用标准曲线法进行定量的方法。
二、实验原理
采用反相液相色谱柱进行分离，以紫外检测器进行检测，以苊（菲）标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度作工作曲线，再根据样品中的苊（菲）的峰面积，由工作曲线算出其浓度。
三、仪器与试剂
1.仪器
Agilent 1200 HPLC（美国Agilent公司），HP工作站，ODS柱，25μL定量环
2.试剂
甲醇（色谱纯）
二次蒸馏水
苊标准贮备溶液（200 mg／L）
菲标准贮备溶液（200 mg／L）
四、实验步骤
1.使Agilent 1200 HPLC色谱仪正常工作，色谱条件如下。
柱温：25℃。
流动相：甲醇／水＝80／20（体积比）。
流动相流量：1.0 mL／min。
检测波长：228 nm。
2.苊标准系列溶液配制：用乙腈将苊标准贮备溶液稀释成浓度为10.0 mg／L标准使用液体。然后取一定量的标准使用液体于乙腈中，制备至少5个浓度点的标准溶液，浓度分别为0.05μg／mL，0.1μg／mL，0.5μg／mL，1.0μg／mL，2.0μg／mL，贮存在棕色小瓶中于冷暗处存放。
3.菲标准系列溶液配制：用乙腈将菲标准贮备溶液稀释成浓度为10.0 mg／L标准使用液体。按上述方法同样配制标准溶液。
4.绘制工作曲线：通过自动进样器或样品定量环分别移取5种浓度标准使用液体，注入液相色谱，得到不同浓度的色谱图，计算不同浓度待测物的相应峰高，绘制标准曲线。
5.样品测定。
五、数据处理
可在“on line”和“off line”HP工作站内处理数据，在“结果预览”中直接得出结果。
六、关机
实验结束后，按要求处理好色谱柱（对于反相柱，用100%甲醇以1 mL／min冲洗10 min），关好仪器。
七、思考题
1.用标准曲线法定量的优缺点是什么？
2.为什么改变流动相配比可以改变分离状况？
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