实验十九 高效液相色谱柱参数测定及内标法定量
一、实验目的
1．学习高效液相色谱仪的基本使用方法。
2．掌握液相色谱柱主要性能参数的测定方法。
3．学会色谱内标定量方法。
二、实验原理
高效液相色谱法是在经典液相色谱基础上发展起来的一种现代柱色谱分离方法。由于采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，所以高效液相色谱可获得很高的分离效率。
与气相色谱不同，高效液相色谱分离不但取决于组分和固定相的性质，还与流动相的性质密切相关。采用非极性的十八烷基键合相（ODS）为固定相和极性的甲醇－水溶液为流动相的反相色谱分离模式特别适用于同系物如苯系物等的分离。
与气相色谱相同，液相色谱柱也是整个高效液相色谱分离系统的核心。液相色谱柱的性能参数主要有以下几项:
1．柱效（理论塔板数）n
式中tR为测试物的保留时间，W1/2为其色谱峰的半峰宽。测定方法与气相色谱实验中相同，计算时tR与W1/2的单位须一致。
2．分离度R
式中tR1、tR2分别为相邻两峰的保留时间，W1、W2分别为两峰的峰底宽。
常用的定量分析方法与气相色谱相同。本实验采用内标法:
式中mi为混合试样中待测组分i的质量;ms为所加内标物的质量;Ai、fi分别为i组分的峰面积和相对质量校正因子。As、fs分别为内标物的峰面积和相对质量校正因子。一般常以内标物为基准，则fs=1，此时计算可简化为
而fi可由内标标样求得:
三、仪器及药品
1．仪器:LC－10AT VP高效液相色谱仪、色谱柱:15cm×4．6mm I．D、ODS、5μm;超声波清洗机、微量注射器（25μL）。
2．药品:流动相:甲醇－水3∶1;样品Ⅰ内标准样由下列3种溶液等体积混合: 0．12mg/ml嘧啶的甲醇溶液，0．7mg/ml苯的甲醇溶液，浓度依次为0．1mg/ml、0．1mg/ml和0．06mg/ml的萘、联苯、菲混合物的甲醇溶液;样品Ⅱ混合试样一定量的尿嘧啶、苯、萘、菲溶于甲醇，其中加入浓度为0．1mg/ml的内标物。
四、实验内容
1．流动相的处理:用液相色谱级无水甲醇和二次去离子重蒸水配制流动相1000ml，混合均匀后经0．45μm膜过滤，再用超声波脱气10分钟。
2．检查色谱系统各部件的连接是否正确，液路有无泄漏。如一切正常，则可将准备好的流动相加到仪器储液瓶中，并将检测器后面的液路出口置于废液瓶中。
3．开机:排除液路中的所有气泡。操作条件设置如下:流动相流速0．5ml/min，压力上限2×104kPa，检测波长254nm，色谱柱温为室温。
4．进样I:待基线平稳后，用液相色谱微量注射器取25μL样品I注入色谱仪进样口，记录色谱图。
5．复测:待5个色谱峰全部流出后（出峰顺序为尿嘧啶、苯、萘、联苯、菲），重复4的实验2次。
6．进样Ⅱ:复测:取25μL样品Ⅱ注入进样口，按照分析内标准样的方法，重复进样3次。
7．关机。
五、实验结果
1．根据样品Ⅰ3次实验所得结果计算色谱柱参数n（以联苯为测试物）、R（相邻两峰），并且以联苯为内标物计算其他4个组分的相对质量校正因子。
2．根据样品Ⅱ3次实验计算混合物中尿嘧啶、苯、萘和菲的含量。
六、实验讨论
1．高效液相色谱仪与气相色谱仪相比有什么相同点和不同点?
2．紫外检测器是否适用于所有有机化合物?为什么?
3．在高效液相色谱实验中，为保护色谱柱、延长其使用寿命，应注意些什么问题?
【注意事项】
1．配制流动相须用液相色谱级溶剂，流动相在使用前必须经过滤和脱气。
2．严格按照液相色谱操作规程进行操作。
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