用高效液相色谱法测定人血浆中扑热息痛的含量

一、 实验目的

（1） 进一步掌握高效液相色谱仪的基本结构和基本操作方法。

（2） 了解人血浆中扑热息痛的提取方法。

（3） 掌握用保留值进行定性分析及用标准曲线进行定量分析的方法。

二、 实验原理

扑热息痛是最常用的非甾体抗炎解热镇痛药， 其解热作用与阿司匹林相似， 镇痛作用较弱， 无抗炎抗风湿作用， 是乙酰苯胺类药物中最好的品种， 用于感冒、 牙痛等症。 健康人在口服药物15min以后， 药物已进入血液。1～2h内， 人的血液中药物含量达到极大值。 用高效液相色谱法测定人血浆中的药物浓度， 可以研究药物在人体内的代谢过程及不同厂家的药物在人体内的吸收情况的差异。 扑热息痛的结构如图5-4所示。

图5－4 扑热息痛的结构

本实验采用扑热息痛纯品进行定性分析， 找出健康人血浆中扑热息痛在色谱图中的位置， 然后以健康人血浆为本底做标准曲线。 从标准曲线中找出并算出人血浆中扑热息痛的含量。

三、 仪器与试剂

1. 仪器

（1） 高效液相色谱仪（带自动进样器， 或配置微量进样器）；

（2） 分析天平；

（3） 容量瓶；

（4） 微量进样器；

（5） 10m L离心管。

2. 试剂

（1） 甲醇（分析纯）；

（2） 扑热息痛（分析纯）；

（3） 三氯乙酸（分析纯）；

（4） 乙腈（色谱纯）；

（5） 纯净水。

四、 实验步骤

1. 色谱条件

色谱柱： C18，4.6mm×150mm，5μm；

流动相： 水-乙腈（90∶10， v／v）；

流速：1m L·min-1；

检测波长：254nm；

柱温：30℃；

进样量：10m L。

2. 操作步骤

（1） 按操作说明书启动仪器。

（2） 标准曲线所用样品的预处理：取健康人血浆0.5m L置于10m L离心管中， 加扑热息痛标准品使其含量分别为0.0μg·m L-1、0.5μg·m L-1、1.0μg·m L-1、2.0μg·m L-1、5.0μg·m L-1、10.0μg·m L-1，再加20％的三乙醇胺甲醇溶液0.25m L-1，振荡1min，离心5min。

（3） 未知血样的预处理： 取未知血样的血浆0.5m L置于10m L离心管中， 加20％的三乙醇胺甲醇溶液0.25m L， 振荡1min， 离心5min。

（4） 取去离心后的上清液20μL， 注入色谱柱， 进行色谱扫描。 除空白血浆离心液外，每一浓度需进行三次测量。

3. 实验数据处理

计算标准曲线的回归方程， 由标准曲线计算未知血样中扑热息痛的浓度。

思 考 题

1. 如何计算本实验的回收率？

2. 为什么要作空白血样的分析？

3. 除用标准曲线法定量外， 还可采用什么定量方法？ 其各有什么优缺点？