中国对虾“黄海号”血细胞和肌肉文库的构建

中国对虾“黄海1号”具有生长快、抗逆性强的优良特性。这一新品种的选育成功，为中国对虾养殖业的可持续发展和处于困境中的中国对虾养殖的“二次创业”提供了重要的品种保障。中国对虾的人工选育工作已取得了一系列研究进展，包括利用RAPD、AFLP和微卫星技术分别对不同地理群体和选育群体不同家系进行遗传多样性分析（孟宪红等，2004；何玉英等，2004；张天时等，2005；Liu et al，2006；岳志芹等，2005）；为进行数量性状位点（QTL）定位和标记辅助选择，采用RAPD、SSR和AFLP技术进行了中国对虾遗传图谱的构建（孙昭宁等，2006；王伟继等，2006；岳志芹等，2004；Li et al，2006；李健等，2008）；利用分子生物学的方法获得与中国对虾生长性状相关的候选标记（刘萍等，2007；何玉英等，2007）。这些研究结果为中国对虾标记辅助育种提供了理论依据，大大加快了中国对虾的标记辅助育种的进程。而关于决定人工选育中国对虾“黄海1号”优良经济性状的分子机制的研究尚未开展。为了深入探讨中国对虾“黄海1号”的优良遗传特性，李吉涛等（2009）构建了中国对虾“黄海1号”的血细胞和肌肉组织cDNA文库，为进一步筛选血液和肌肉特异表达基因奠定分子基础。

本实验所用中国对虾取自中国对虾“黄海1号”下营良种推广基地，活体采取血液和肌肉组织，立即置于液氮中，以备提取RNA。

从电泳结果可以看出（图4），18S、28S rRNA条带清晰，总RNA较完整。分光光度计检测，血细胞总RNA样品的OD260/OD280为1.82，肌肉总RNA样品的OD260/OD280 为1.85，说明总RNA纯度较高。纯化mRNA是获得高质量的cDNA文库的关键，分离纯化的mRNA琼脂糖电泳检测（图5），可见呈smear现象，纯度和大小符合理论值，可以用于构建高质量cDNA文库。

图4　中国对虾血细胞和肌肉总RNA电泳图

1：从血细胞提取的总RNA；2：从肌肉组织提取的总RNA

图5　中国对虾血细胞和肌肉mRNA电泳图

M： DL2000相对分子质量标准；1：血细胞mRNA；2：肌肉mRNA

采用SMART技术，用50 ng血细胞或肌肉mRNA反转录成单链cDNA，通过LD-PCR扩增获得双链cDNA，取5mL PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，相对分子质量大小分布于0.1～10 kb，大小分布均匀（图6），满足cDNA文库的构建要求。cDNA片段用CHROMA SPINTM-400分离柱分级分离，取3mL分离产物进行电泳，发现cDNA片段从第5管后出现，收集第5～8管可以确保cDNA片段大于400 bp，可以用于构建cDNA文库。

图6　中国对虾血细胞和肌肉双链cDNA电泳图

M：13103相对分子质量标准；1：血细胞双链cDNA；2：肌肉双链cDNA

收集的cDNA片段与λTriplEx2载体重组，体外包装和文库贮存按Promega公司的Packagene®Lambda DNA包装系统说明书进行。我们发现cDNA和载体的摩尔比在1：1时能产生有效的重组体。包装后血细胞cDNA文库容量为2.36×106，肌肉文库容量为0.77.3　106，文库扩增后，血细胞文库滴度为5.6.3　109 pfu/mL，肌肉文库滴度为3.0.3　109 pfu/mL，经IPTG诱导检测，重组率均达到98%以上；从各文库随机取出10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，其插入片段长度为400～2.0.0　bp（图7和图8）。证明两文库质量较好。

图7　中国对虾血细胞cDNA文库噬菌斑的PCR扩增产物电泳图

M： DL2000相对分子质量标准；1-10：代表10个克隆的PCR产物

图8　中国对虾肌肉cDNA文库噬菌斑的PCR扩增产物电泳图

M： DL2000相对分子质量标准；1-10：代表10个克隆的PCR产物

构建cDNA文库并从中筛选目的基因是一种十分有效的寻找新基因的手段，因为cDNA文库是众多cDNA序列的集合，不包含繁复的基因组序列，直接编码氨基酸，因此包含了大量基因资源和信息，这使得基因的寻找更容易、快捷，并且使功能克隆新基因更有效。评价一个cDNA文库主要考虑三个因素：① 要有足够的克隆数，能够包含目的序列，特别是那些来自低丰度mRNA；② cDNA小片段（,500 bp）插入的克隆数较少；③ 由近于全长的mRNA拷贝cDNA插入组成，以便能获得全长基因。SMART为获得全长cDNA提供了技术保障。本研究采用SIMART技术成功构建的中国对虾“黄海1号”血细胞和肌肉cDNA文库，原始文库容量分别为2.36.3　106.0.77　3106，重组率达到98%以上，扩增后文库的滴度分别达5.6.109　pfu/mL、3.0.109　pfu/mL，大大超过了cDNA文库构建的基本要求。cDNA文库的插入片段长度分布于400～2.0.0　bp，说明两文库的质量较高，为进一步筛选、克隆新基因提供了重要资源。目前，作者已成功从肌肉文库中克隆了肌钙蛋白I基因cDNA全长，已被基因文库收录（GenBank登录号：FJ609301）。

随着对虾育种工作的深入，与对虾经济性状相关的重要基因的筛选、克隆与功能分析已经成为研究热点之一。cDNA文库是当前发现新基因和研究基因功能的基本工具，因此构建对虾特定部位组织的cDNA文库，可以从中筛选和克隆与对虾各项生理活动相关的功能基因，为进一步进行基因功能验证以及应用奠定基础。关于中国对虾cDNA文库的构建工作已有一些报道，李太武等（1998）用成虾头胸部（去头胸甲及胸部附肢）作为实验材料构建了cDNA文库，获得了一定数量的克隆。张晓军等（2005）构建了中国对虾6种组织（血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织）的cDNA文库。王维新等（2004）构建了中国对虾鳃细胞全长cDNA文库。本研究以人工选育的海水养殖动物新品种中国对虾“黄海1号”为材料，构建了血细胞和肌肉的全长cDNA文库，为有效保存种质资源和后续功能基因的开发奠定了重要基础。

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