中国对虾基因克隆

19.2.1　中国对虾Imd基因全长

中国对虾Imd基因全长783个碱基，其中开放阅读框483个碱基，编码160个氨基酸，cDNA全长中包含59非编码区（59-UTR）的45个碱基，39非编码区（39-UTR）的255个碱基及终止密码子TGA。Imd蛋白的推导相对分子质量1 8123.64，理论等电点为8.022，22个碱性氨基酸，21个酸性氨基酸，44个疏水性氨基酸，39个亲水性氨基酸。对其进行保守结构域预测得知其氨基酸序列包括一个位于C端的死亡结构域，与凡纳滨对虾的IMD死亡结构域基本一致。

图40　中国对虾Imd基因的cDNA序列及其演绎的氨基酸序列

19.2.2　系统进化树分析

将克隆所得到的中国对虾Imd基因的cDNA序列经NCBI网站基因序列BLAST比对，发现中国对虾的Imd基因与凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）和日本囊对虾（Marsupenaeus japonicus）的同源性最高，分别为99%和88%。与其他无脊椎动物如丽蝇蛹集金小蜂（nasonia vitripennis）、沙漠蝗虫（Schistocerca gregaria）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、意大利蜜蜂（Apismellifera）、大蜜蜂（Apis dorsata）、黑小蜜蜂（Apis andreniformis）、果蝇（Drosophilasimulans）的同源性分别为24%、27%、23%、28%、28%、27%、27%。与印度跳蚁（Harpegnathossaltator）、弗罗里达弓背蚁（Camponotus floridanus）、顶切叶蚁（Acromyrmex echinatior）等节肢动物及文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense）和海象（Odobenus rosmarus divergens）、人类（Homosapiens）等脊椎动物的RIP1基因也具有一定同源性。选择一些相近物种中与中国对虾Imd基因的cDNA序列同源性较高的基因，进行氨基酸序列的同源性序列比对，用MEGA4 软件建立系统进化树，进行分子系统学分析。在构建进化树的基础上研究其保守区的死亡结构域（CDD）与其他物种的死亡结构域（CDD）的进化关系。

图41　Imd氨基酸序列的NJ系统进化树

Apis dorsata：大蜜蜂，ACT66899.1；Apismellifera：意大利蜜蜂，NP_001157189.1；Apis andreniformis：黑小蜜蜂，ACT66898.1；Harpegnathossaltator：印度跳蚁，EFN80203.1；Camponotus floridanus：弗罗里达弓背蚁，EFN61166.1；Acromyrmex echinatior：顶切叶蚁，EGI66844.1；Nasonia vitripennis：蝇蛹金小蜂，NP_001135910.1；Schistocerca gregaria：沙漠蝗虫，AFK75938.1；Drosophilasimulans：拟果蝇，AAQ64725.1；Tribolium castaneum：拟谷盗，XP_971829.1；Litopenaeus vannamei：凡纳滨对虾，ACL37048.1；Fenneropenaeus chinensiss：中国对虾，JX867731；Marsupenaeus japonicus：日本囊对虾，BAH86597.1；Branchiostoma belcheri tsingtauense：文 昌 鱼，AEO79023.1；Orcinus orca：虎 鲸，XP_004281119.1；Homosapiens：人，NP_003795.2；Odobenus rosmarus divergens：海象，XP_004408463.1

从该基因系统进化树分析，中国对虾Imd基因与日本囊对虾和凡纳滨对虾Imd基因的亲缘关系最近，聚为一支，与文昌鱼、虎鲸、人、海象的RIP1基因聚为一类。

19.2.3　鳗弧菌对中国对虾血淋巴Imd和Relish基因表达的影响

图42　鳗弧菌侵染后中国对虾Imd和Relish基因在血淋巴中的表达情况

注：同时间点两组无星号表示差异不显著（P . 0.05），一个星号表示差异显著（P , 0.05），两个星号表示差异极显著（P , 0.01）。

注射鳗弧菌后血淋巴中Imd基因的表达量相比对照组出现极显著的上调表达（P , 0.01），且实验组的变化趋势为先升高后降低，在注射鳗弧菌后的24小时表达量达峰值。注射鳗弧菌后血淋巴中Relish基因的表达量在前6小时出现极显著上调（P , 0.01），注射后1小时表达量最高，之后趋于正常，整体变化趋势为逐渐下降。

本研究首次克隆得到中国对虾Imd基因序列，全长783 bp，其中开放阅读框483 bp，编码160个氨基酸，序列分析发现，该Imd基因含有一段高度保守的CDD死亡结构域。与其他动物氨基酸序列的比对发现该序列与凡纳滨对虾和日本囊对虾等已知甲壳动物的同源性达80%以上，与果蝇的Imd蛋白及人类肿瘤坏死因子的受体交互作用蛋白1（R1P1）具有相似性。此类蛋白可能属于死亡结构域超家族的一员，此类超家族充当细胞信号通路的接合体，可募集其他蛋白进入信号复合体。有研究发现，受体相互作用蛋白1 是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以通过激活NF-κB活化caspase- 8 参与活性氧的产生等，在细胞凋亡、细胞存活及细胞程序性坏死等信号传导中起关键作用（Lemaitre et al，1995）。在无脊椎动物中Imd基因编码一种免疫缺陷蛋白IMD，在抵御革兰氏阴性菌过程中产生突变（郭志勋等，2006），通过一系列级联放大反应诱导激活NF-κB转录因子，发挥抗菌作用。

从感染鳗弧菌后48小时内中国对虾的累积死亡率呈直线上升，48小时后再无死亡，说明对虾能迅速清除入侵体内的鳗弧菌，随着感染时间的延长减少的血淋巴细胞在细菌侵入体内后48小时得以恢复（Zaidman et al，2006），存活下来的对虾恢复正常生理机能不再死亡。受到鳗弧菌侵染后的中国对虾血淋巴中Imd基因的表达量呈现先升高后降低的趋势，但整体上相对于对照组表达上调，说明机体对鳗弧菌的入侵产生了响应，而且这种响应一直持续到实验结束，说明受到Imd基因编码的IMD接头蛋白被激活后一直保持防御状态，受侵染24小时后其表达量达到最大值，之后逐渐降低，可能是由于Imd信号通路被激活后导致通路上游肽聚糖识别蛋白的上调，该蛋白能够降解细菌的肽聚糖从而使得Imd基因表达量相对降低，起到负调控作用（李中海等，2002）。而Relish基因在受到鳗弧菌侵染后的前6小时里血淋巴内基因表达量明显高于对照组，说明受到外界病原菌刺激后中国对虾体内的核转录因子Relish被激活，与抑制蛋白IkB解离，转入细胞核内激活抗菌肽等免疫基因的转录及诱导炎症因子iNOS等的表达，这与果蝇体内Imd信号通路的激活途径相一致（Lindsey et al，2012）。但是其变化趋势是逐渐降低的，直至与对照组无显著差异，出现这种情况的原因可能是受到通路中Imd接头蛋白下方的Casper负性调节蛋白的控制，使得信号通路下游的核转录因子Relish基因的表达量处于一定的平衡范围之内。Lindsey等（2012）用疟原虫感染疟蚊研究Imd信号通路的相关因子，通过沉默Casper负性调节蛋白或使Relish过表达后发现抗菌肽大量表达使得疟蚊的抗菌力增强。

综上所述，本研究成功克隆中国对虾Imd基因全长序列，并在此基础上用鳗弧菌刺激中国对虾，分析Imd信号通路相关基因的表达情况发现Imd和Relish基因的表达与弧菌刺激密切相关，提示Imd和Relish基因可能参与了对虾抗革兰氏阴性菌反应的Imd信号转导通路中，为深入研究Imd通路在免疫防御中的重要作用奠定了基础。