中国对虾基因的组织表达分析

利用RT-PCR分析中国对虾FcMKK4基因在不同组织中的表达水平，结果表明，FcMKK4基因在肌肉、肝胰腺、淋巴、心脏、胃、鳃、肠、血细胞中均有表达。在肌肉中的表达量最高（为血细胞中表达量的13.47倍），其次为肝胰腺 . 心脏 . 鳃 . 胃 . 淋巴 . 肠（分别为血细胞中表达量的7.19倍、6.60倍、6.46倍、6.44倍、5.34倍和4.23倍），在血细胞中的表达量最少。

图37　中国对虾FcMKK4基因在不同组织中的表达分布

1：肠；2：鳃；3：胃；4：心脏；5：淋巴；6：肝胰腺；7：肌肉；8：血细胞。

图37为氨氮胁迫后，中国对虾FcMKK4基因在各组织中的相对表达量变化。结果显示，与对照组相比，FcMKK4基因相对表达量在鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中首先表现为下调趋势，其中在鳃、胃、肝胰腺、肌肉和血细胞中的相对表达量在3 h最低，分别为对照组的0.58倍（P , 0.01）、0.79倍（P , 0.05）、0.18倍（P , 0.01）、0.60（P , 0.01）倍和0.53倍（P , 0.01）；在心脏中的相对表达量在6 h最低，为对照组的0.87倍（P . 0.05）。随后，FcMKK4基因的相对表达量出现上调，并分别在72、72、6、48、72 和48 h达到最大值，相对表达量分别为对照组的3.94倍（P , 0.01）、3.44倍（P , 0.01）、1.72倍（P , 0.01）、1.84倍（P , 0.01）、1.36倍（P , 0.01）和2.35倍（P , 0.01），且FcMKK4的相对表达量总体呈现先下降后上升再下降的变化趋势。

与上述情况相反，氨氮胁迫后，中国对虾FcMKK4基因在肠中的相对表达量呈现先上调后下调再上调的变化趋势，且分别在24 h和96 h达到最大值，相对表达量分别为对照组的2.17倍（P , 0.01）和2.97倍（P , 0.01）。在各时间点，氨氮胁迫组FcMKK4基因的相对表达量均高于对照组。

MKK4基因自从非洲爪蟾中首次被克隆以来，其分子功能及机制等得到较为深入的研究，但主要结果大多来自人和小鼠等生物，且与生长及免疫过程密切相关。在甲壳动物中仅见水蚤（Daphnia pulex）（Colboume et al，2011）和斑节对虾（孙文文等，2012）有报道。本研究从中国对虾EST文库中查找比对获得中国对虾MKK4基因一段序列，克隆获得其全长，并命名为FcMKK4。该基因全长2.0.4　bp，其开放阅读框1.2.1　bp，编码一个由406个氨基酸组成的多肽。三级结构预测显示，软件只能预测同源性部分（氨基酸残基范围98～391）的模型，因此估计，前段几十个氨基酸残基很可能是loop区，对整体构型影响不大，和油菜（Brassica campestris L.）BnMKK4预测结果相似（张国腾等，2012）。信号肽预测结果显示，FcMKK4不含信号肽，与油菜BnMKK4结果不同[31]，表明MKK4基因在植物和动物中表达存在明显差异。保守结构域分析表明，FcMKK4基因预测蛋白存在S-TKc保守结构域，且该蛋白属于PKc超家族，PKc-MKK4亚族。经BLASTP比对，FcMKK4基因编码的蛋白质属于MKK4家族，且与其他无脊椎动物的MKK4具有高度同源性（68%～80%）。系统进化分析表明，中国对虾FcMKK4与无脊椎动物聚为一支。MKK4是一个高度保守的基因，已在多种动植物中分离出MKK4基因的同源序列。同源序列分析表明，FcMKK4基因编码的氨基酸序列与其他物种一样高度保守，且GYDVRSDVWSLGTTL基序在无脊椎和脊椎动物中均高度保守。综上所述，可以确定该序列为中国对虾MKK4基因序列。

图38　氨氮胁迫后中国对虾FcMKK4基因在不同时间的表达变化

a：肠； b：鳃； c：胃； d：心脏； e：肝胰腺； f：肌肉； g：血细胞

对MKK4 在不同物种各组织中的表达情况的研究表明，在成年小鼠（Musmusculus）和人类的各组织中MKK4mRNA均广泛表达，且在骨骼肌和大脑中的表达量较高。在斑节对虾各组织中也均有表达（孙文文等，2012），且存在明显的组织差异性。与斑节对虾相比，MKK4在中国对虾各组织中均有表达，但表达趋势有所不同。中国对虾FcMKK4基因在肌肉中的表达量最高，其次为肝胰腺、心脏、鳃、胃、淋巴、肠，在血细胞中的表达量最少。而斑节对虾MKK4基因组织相对表达量由高到低依次为肠、鳃、淋巴、肝胰腺、心脏和血细胞，这可能与选取的实验对虾处于不同的生长发育阶段有关，因为MKK4在生物生理过程中起着重要作用，不同的生长发育阶段可能有着不同的组织分布。

由于MKK4基因在生物生理及病理过程中起着重要作用，近年来已在多个物种中进行了研究。对小鼠及人的研究主要集中于MKK4基因在细胞凋亡、炎症反应和肿瘤发生中的重要作用，在植物中则有MKK4基因参与非生物胁迫及病害相关的信号传导的报道。Kong等（2011）的研究表明，玉米（Zeamays）中ZmMKK4的转录水平受到冷胁迫、盐胁迫和外源H2O2胁迫的影响而出现上调，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，ZmMKK4基因的过表达则可增加对冷胁迫和盐胁迫的抗性。Jonak等（1996）研究发现，冷刺激能够激活紫花苜蓿（Medicagosativa L.）中的p44MKK4基因的表达和活性。张国腾等（2012）的研究则表明，油菜（B.campestris L.）中BnMKK4基因的表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导。为探索中国对虾FcMKK4基因在非生物胁迫应答中的作用，本研究采用64mg/L的NH4Cl海水溶液对中国对虾进行氨氮胁迫实验，结果表明，中国对虾鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉、血细胞和肠中FcMKK4的表达量均有明显的胁迫时间差异。氨氮胁迫后，在鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中的表达量先下调后上调，在肠中表达量则先上调后下调，且在各组织中各时间点FcMKK4的表达量变化不尽相同，其原因可能是组织器官功能差异性所致（2012）。中国对虾FcMKK4基因在组织中的表达量无论是先下调后上调（如鳃、胃等），还是先上调后下调（如肠），其总体趋势呈现出上调和下调波动性反复变化的趋势，由此可推测，中国对虾FcMKK4基因在抵抗持续性氨氮胁迫中起着重要作用。关于MKK4在虾类中的作用机制方面的研究尚未见报道，而虾类MKK4是否具有与其他动物MKK4相似的功能，还有待进一步的研究。