拟南芥-插入突变体库的获得

实验八　拟南芥T-DNA插入突变体库的获得

【实验目的】

1.了解T-DNA插入获得突变体的原理。

2.掌握获得拟南芥T-DNA插入突变体库的方法。

【实验原理】

获得T-DNA插入突变体的基本原理是将含有已知DNA序列的T-DNA载体通过转化插入植物基因组中，使得插入位点基因的功能缺失或获得，从而造成突变。该方法通过插入的报告基因的表达来研究被插入基因的表达模式，而且对致死基因也可以在杂合状态下进行研究。由于报告基因是显性的，通过检测报告基因的活性分析基因的表达情况，从而使得冗余基因得以标记。对于能够产生突变体表型的T-DNA插入，由于报告基因的检测很方便，使得表型和T-DNA的共分离分析变得更加简单。这种技术称为T-DNA诱捕技术。常用的有三种类型的诱捕技术:增强子诱捕(enhancer traping)、启动子诱捕(promoter traping)和基因诱捕(gene traping)。

【实验材料】

拟南芥:拟南芥种植在22～23℃温室中，满足16小时光照条件。

【实验器材】

恒温振荡培养箱;低温冷冻离心机; PCR仪等。

【药品试剂】

农杆菌GV3101;载体pSKI015; LB培养基。

PCR相关试剂: Taqase，dNTPs，10倍反应缓冲液，35S启动子引物(具体序列见实验十七中图2-1)。

0.2%除草剂Basta; Silwetl-77; 50%蔗糖。

【实验方法】

1.拟南芥的种植:拟南芥种子均匀播种于蛭石中，每盒种4株。

2.菌种培养:将含有激活标记载体pSKI015的农杆菌菌种划平板进行活化，28℃恒温倒置培养两天后挑取多个单克隆，分别接种于5ml液体LB培养基(添加50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素)中，28℃，220r/min条件下振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.5左右(约培养1天)，用于PCR检测。

3.激活标记载体4个串联增强子的PCR检测:带有激活标记载体的农杆菌在4℃保存或继代培养时，载体上的4个串联增强子容易逐个丢失。菌种在使用前需用PCR的方法检测增强子是否完整。如果串联增强子完整，PCR产物电泳结果应包括一条长度为1.46kb的相对很亮的特异条带。

4.转化用农杆菌菌液的制备:取PCR检测含有4个完整增强子的农杆菌GV3101约100μl接种于50ml液体LB培养基中扩大培养(添加50mg/L卡那霉素和50mg/L氨苄青霉素)，28℃，220r/ min振荡培养(大约培养1天)至菌液OD₆₀₀为1.0左右，倒入大离心管中，5000r/min离心5分钟，弃上清液，沉淀用50%蔗糖重悬，最终菌液OD₆₀₀在0.8～1.0左右，在农杆菌菌液中加入0.2μl/ ml Silwetl-77，即可用于转化。

5.根瘤农杆菌介导的花侵染法转化拟南芥，见第一部分第二节实验五的操作步骤。

6.除草剂Basta抗性苗的筛选:待农杆菌转化的拟南芥种子成熟后，将种子收集，烘干后除去果荚皮等杂质，然后进行抗性筛选。具体过程如下:将收获的转基因拟南芥T1代种子再种植于蛭石中，使其萌发。待幼苗长出两片真叶后，用0.2%的Basta溶液喷洒，没有黄化的绿苗即为Basta抗性苗，从拟南芥Basta抗性苗中提取DNA并进行PCR检测，然后用Tail-PCR法扩增得到侧翼序列，分析得知所激活的基因的序列及功能，建立激活标记突变体库。

【思考题】

简述T-DNA诱捕技术获得突变体库的原理和操作方法。