胁迫对中国对虾抗氧化酶基因表达的影响

6.2.1　pH胁迫对中国对虾CAT基因表达的影响

pH7.0胁迫条件下，中国对虾鳃、肌肉和血淋巴CAT基因表达整体呈现先升高后降低再升高再降低的波浪式变化趋势，均在72 h达峰值（P , 0.05），肝胰腺CAT基因表达水平均显著高于对照组（P , 0.05），且于12 h达峰值（P , 0.05）；pH 9.0胁迫组，中国对虾鳃、肝胰腺、肌肉组织和血淋巴CAT基因表达水平整体呈现先升高后降低再升高的变化趋势，分别于3 h、72 h、24 h和24 h达峰值（P , 0.05）。

图14　中国对虾不同组织CAT基因相对表达水平随

pH胁迫时间的变化情况（a）鳃（b）肝胰腺（c）肌肉（d）血淋巴注：与对照组相比，*表示差异显著（P , 0.05）

6.2.2　pH胁迫对中国对虾Prx基因表达的影响

pH 7.0胁迫组，中国对虾鳃和肝胰腺Prx基因表达呈现先降低后升高的变化趋势，均在120 h达峰值（P , 0.05），肌肉Prx基因表达水平基本显著高于对照组（P , 0.05），且于72 h达峰值（P , 0.05），血淋巴Prx基因表达水平12 h达峰值（P , 0.05），之后逐渐降低；pH 9.0胁迫组，中国对虾鳃和肌肉组织Prx基因表达水平基本呈现先升高后降低的变化趋势，分别于3 h和120 h达峰值（P , 0.05），肝胰腺和血淋巴Prx基因表达水平呈现先降低后升高的变化趋势，分别于148 h和96 h达峰值（P , 0.05）。

活性氧（氧自由基）主要包括超氧阴离子（O22）、羟自由基和H2O2，其中超氧阴离子的寿命最长（文春根等，2009），可以从其生成的位置扩散到较远的靶位置（张庆利等，2007）。正常生理条件下适量的活性氧对机体具有一定的积极作用，但过量的活性氧则导致机体的氧化胁迫（Franco et al，2009）。体内抗氧化系统包括非酶类及酶促体系，后者主要有过氧化氢酶、过氧化物还原酶等，机体通过抗氧化系统清除体内过量的活性氧，保护各组织器官免受活性氧的损伤（Mathew et al，2007）。

图15　中国对虾不同组织Prx基因相对表达水平随pH胁迫时间的变化情况（a）鳃（b）肝胰腺（c）肌肉（d）血淋巴

注：与对照组相比，*表示差异显著（P , 0.05）

试验发现中国对虾抗氧化酶活力存在组织差异性，肝胰腺T-AOC和CAT活力明显高于其他三个组织，这与三疣梭子蟹的研究相一致（陈萍等，2009）。这可能与不同组织的功能定位有关。肝胰腺是对虾蛋白、脂类等营养物质的代谢中心，为避免过量活性氧对肝胰腺实质细胞及脂质类物质的破坏，需要较强的抗氧化酶体系确保活性氧在正常的生理水平。

pH胁迫3 h后中国对虾各组织T-AOC、抗超氧阴离子和CAT活力升高，可能是pH的急剧变化诱导中国对虾体内活性氧的产生，对虾各组织反馈性增强抗氧化系统酶活力，以清除多余的活性氧，从而保护机体免受损伤；各项指标基本在12 ～ 24 h达峰值，这与Stebbing提出的“毒物兴奋效应”表现类似（Stebbing et al，1982）。但随着胁迫时间的延长，抗氧化酶活力明显降低。pH胁迫中国对虾148 h，各组织T-AOC、抗超氧阴离子和CAT活力基本低于对照组，表明长时间pH胁迫抑制了对虾抗氧化系统酶活力。据报道，过量活性氧的积累可导致线粒体DNA的损伤，破坏细胞电子传递链、线粒体膜电位及ATP能量产生，进而导致细胞的呼吸障碍，严重时甚至导致细胞的凋亡或者坏死，机体抗氧化能力明显降低（Dandapat et al，2003；Ott et al，2007）。但长时间pH胁迫是否造成中国对虾各组织细胞凋亡或坏死，还需要通过进一步组织切片观察确认。

试验还发现，在低pH（7.0）和高pH（9.0）胁迫条件下，中国对虾肝胰腺和鳃抗氧化系统酶活力较其他三个组织最早达到峰值，这说明不同组织应对高pH、低pH胁迫时的敏感程度存在差异。低pH环境下，对虾血淋巴pH降低，血蓝蛋白与氧气的结合能力下降（潘鲁青等，2008），可能引起组织缺氧，导致参与电子转运的黄素二核腺苷酸（FADH）、半醌辅酶Ⅰ（NADH）得不到氧化而堆积，而NADH是有效的电子供体，可使溶解在脂膜中的氧分子单价还原，导致活性氧的大量产生（陈丽芬等，2006），由此推测作为能量与物质代谢中心的肝胰腺，在缺氧条件下可能较其他组织产生更多的活性氧，因而对低pH胁迫比较灵敏。鳃是水产动物的一个多功能器官，具有呼吸、渗透和酸碱平衡等重要功能（Evans et al，2005）。pH值升高使水体OH2增多，促使无毒的NH41向有毒的NH3转化，NH3主要以扩散方式通过鳃排出（Weihrauch et al，1998），水体氨氮含量的升高导致细胞内活性氧的增加（肖涛等，2006；Wang et al，2008）。高pH直接影响中国对虾鳃组织的呼吸功能，增加鳃组织的活性氧积累，所以鳃组织最先表现出抗氧化系统的激活，各项指标基本在3 h达峰值，提示中国对虾鳃组织可以作为高pH胁迫的敏感组织。

CAT是一类重要的抗氧化酶类，主要通过还原H2O2参与机体的生理过程。pH胁迫初期机体通过增加CAT基因表达水平，从而增强抗氧化系统功能，各组织CAT 基因表达水平一般在24～72 h达到最高值。但pH 7.0胁迫组肝胰腺和pH 9.0胁迫组鳃CAT基因表达水平分别在12 h和3 h达峰值，均早于其他组织，由于CAT对于低浓度H2O2不敏感（Rhee et al，2005），推测上述两组织在pH胁迫初期产生大量H2O2，所以最早出现诱导CAT基因表达水平上调，这与CAT酶活性变化特性比较吻合。Wang等研究发现，在低pH（5.6）胁迫条件下，凡纳滨对虾肝胰腺CAT基因表达水平12 h达最高值，24 h后恢复至正常水平；在高pH（9.3）胁迫条件下，凡纳滨对虾肝胰腺CAT基因表达水平没有明显变化（Wang et al，2009）。这与低pH胁迫中国对虾肝胰腺CAT基因表达变化相似，但与高pH胁迫中国对虾肝胰腺CAT基因表达变化差别较大，原因可能与实验动物品种及胁迫水平不同有关。

Prx具有分解H2O2和过氧化物的作用，并间接调节细胞内的信号传递（Wood et al，2003；Lehtonen et al，2005）。试验结果表明，pH胁迫中国对虾后，各组织Prx基因表达水平72～148 h达到峰值，比CAT基因表达时间延后24～72 h，推测长期pH胁迫后各组织积累了大量的H2O2，当细胞内H2O2浓度较高时，部分Prx就形成没有过氧化酶活性的环状十聚体，作为分子伴侣保护其他功能蛋白分子（Jang et al，2006；郑振华等，2008），为了降低pH胁迫对中国对虾造成的氧化损伤，各组织Prx基因转录要保持在一定水平内，所以pH胁迫中国对虾148 h各组织Prx基因表达仍然处于较高水平。

综上所述，pH胁迫影响中国对虾抗氧化系统酶活力及基因表达水平，并表现出一定的时间规律性。pH胁迫3～24 h能够诱导抗氧化系统的功能，以抵抗pH胁迫对机体产生的氧化胁迫，且短期的pH胁迫可能具有一定的积极作用，郑振华等认为pH周期性向碱性环境方向波动能促进南美白对虾的生长[35]。但长时间pH胁迫则会抑制中国对虾抗氧化系统功能，推测可能是长时间pH胁迫导致中国对虾机体产生过量的活性氧，超出了机体抗氧化系统所能调节的范围，由此造成氧化损伤，因此在实际养殖生产中要避免中国对虾长期处于pH胁迫环境。